13．2．1　黃嘌呤氧化酶－細胞色素c法（McCord法）

13．2．1．1　原理

在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤生成尿酸，同時產生，將氧化型細胞色素c還原為還原型細胞色素c，后者在550nm有最大吸收。存在SOD時，被催化而歧化，細胞色素c還原反應速率則降低。根據細胞色素c在加入SOD前后被還原的速率變化以測定SOD活性。

在細胞色素c還原法中，產生體系為黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶，其檢測體系為可被還原的氧化型細胞色素c。

兩種反應的速率之比取決于pH、黃嘌呤濃度與O₂的分壓。pH與O₂的分壓愈高，則的產量愈增加，而增高的黃嘌呤濃度卻使產量下降。

13．2．1．2　酶活性單位定義

在pH為7．8、25℃的實驗條件下，3mL反應液中，每1min抑制氧化型細胞色素c還原率達50%的酶量定為一個活性單位或McCord單位（u），測定波長為550nm，并規(guī)定每1min的吸光度變化值（ΔA_550nm）保持在0．025min。

式中，ΔA₅₅₀為氧化型細胞色素c還原的每1min 550nm吸光度變化值；V_總為測定反應液總體積，為3mL（V_定義：3mL）；V_樣為測定反應所用樣品體積，為0．3mL。

13．2．1．3　測定方法

pH為7．8，0．3mmol/L磷酸鉀緩沖液（含0．6mmol/L EDTA）0．5mL，6×10^－5mol/L氧化型細胞色素c 0．5mL，0．3mmol/L黃嘌呤液0．5mL，雙蒸水1．3mL，在25℃預保溫10min，最后加入9．0×10^－5u/mg的黃嘌呤氧化酶0．2mL，并立即計時，速率變化在2min內有效，控制黃嘌呤氧化酶濃度，使ΔA_550nm為0．025/min，測定SOD活性時，加入0．3mL SOD待測液，雙蒸水減至1．0mL，根據抑制程度，計算出SOD活性（見表13－2）。

表13－2　黃嘌呤氧化酶－細胞色素c法加樣表

13．2．1．4　方法特點

該法為最早建立的活性測定法，被認為是一種經典可靠的方法，可應用于生物樣品中Cu，Zn－SOD的活性測定。雖然產量很低，但很穩(wěn)定，符合酶活性測定的要求。常存在氧化型細胞色素c和黃嘌呤氧化酶不純的問題。

生物樣品中易有干擾雜質，靈敏度較低。靈敏度可采取以下措施得到提高：①用乙酰化細胞色素c代替細胞色素c，可將靈敏度提高一倍，而且使測定結果不受樣品中細胞色素c氧化酶的影響；②將pH為7．8，0．05mmol/L磷酸鉀緩沖液換成pH為10．2的碳酸鹽緩沖液，并將黃嘌呤濃度從0．05mmol/L增至0．10mmol/L，靈敏度可提高10倍；③預先將黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶溶液在25℃下保溫10min，使產量達到穩(wěn)定程度，即產生率與其自動歧化率達到平衡，靈敏度增加可高達10倍；④另外有報道，利用FP9平行分析儀可進行半自動分析，快速、簡便，可以同時測定多個樣品。