菠蘿蛋白酶的制備及鑒定_實(shí)用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)訓(xùn)三　菠蘿蛋白酶的制備及鑒定

實(shí)訓(xùn)目的

（1）系統(tǒng)地學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取、分離純化技術(shù)的原理及實(shí)訓(xùn)技術(shù)。

（2）熟練掌握硫酸銨鹽析法、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、蛋白質(zhì)純度鑒定等實(shí)訓(xùn)技術(shù)。

（3）掌握菠蘿蛋白酶的酶活性檢測(cè)方法。

實(shí)訓(xùn)原理

菠蘿蛋白酶，相對(duì)分子質(zhì)量為33　000，等電點(diǎn)為9.55，最適pH值為5.0～8.0，最適溫度為40～70℃。菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白酶，廣泛存在于菠蘿的果實(shí)、芽、葉及莖中，能分解蛋白質(zhì)、肽、酯和酰胺，其成品為淺黃色、無(wú)定形粉末，稍溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚，微有臭味，其酶活性能被半胱氨酸激活，而受重金屬抑制。菠蘿蛋白酶用途廣泛，可用于干酪、明膠、水解蛋白的生產(chǎn)，也可作為一種食品添加劑，可使肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清，還可以治療生物體水腫及多種炎癥，能迅速溶痂，對(duì)正常組織無(wú)害，適用于中、小面積深度燒傷的治療。

要研究某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，生產(chǎn)具有高生物活性的蛋白質(zhì)類激素、酶等，第一步工作就是從復(fù)雜的混合體系中分離出蛋白質(zhì)并且進(jìn)行純化分析。

1.蛋白質(zhì)分離純化的一般程序

（1）選擇一種目的蛋白質(zhì)含量豐富、穩(wěn)定性好的樣品材料。

（2）將目的蛋白質(zhì)從樣品中抽提出來(lái)。

（3）確定分離純化的方法，使粗品的純度達(dá)到預(yù)定要求。

（4）建立靈敏、特異、精確的檢測(cè)手段，分步測(cè)定目的蛋白質(zhì)的含量，檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍踪|(zhì)的純度。

（5）在操作、分析過(guò)程中注意保護(hù)目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，防止其變性。

2.蛋白質(zhì)的分離純化方法

利用蛋白質(zhì)溶解度不同的分離純化方法有鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法等，主要生產(chǎn)方法有單寧沉析法、高嶺土吸附法和超濾法。

鹽析法是粗分離蛋白質(zhì)的重要方法之一。在稀鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而升高，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當(dāng)鹽濃度增加到一定量時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度又逐漸下降，直到某一濃度時(shí)便從溶液中析出，稱為鹽析。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子吸附某種鹽離子后，其帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用卻加強(qiáng)，因而溶解度提高，但當(dāng)大量中性鹽加入時(shí)，水的活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面的電荷逐漸被中和，水化層逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子相互聚集并從溶液中析出。

用于鹽析的中性鹽通常有硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鎂等，而以硫酸銨的效果為最佳，它在水中溶解度大而溫度系數(shù)?。ㄔ?5℃時(shí)，其溶解度為767g／L；在0℃時(shí)，其溶解度為697g／L），分離效果好，能保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，且價(jià)廉易得。不同蛋白質(zhì)在鹽析時(shí)所需鹽濃度不同，故調(diào)節(jié)鹽濃度可適當(dāng)將蛋白質(zhì)分離。如雞蛋清中的球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀，清蛋白在飽和硫酸銨溶液中沉淀。

3.菠蘿蛋白酶活性測(cè)定

酪蛋白是一種蛋白質(zhì)，它被菠蘿蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光區(qū)275 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，根據(jù)測(cè)定275nm波長(zhǎng)處的吸光度，可以判定菠蘿蛋白酶的酶活性。吸光度的大小與酪氨酸含量的多少有關(guān)，吸光度大說(shuō)明酪氨酸含量高，也意味著菠蘿蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活性也高。

4.菠蘿蛋白酶的含量測(cè)定

由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)溶液在紫外光區(qū)280nm波長(zhǎng)處具有吸收峰。某蛋白質(zhì)溶液的濃度與其在一定波長(zhǎng)光線下的吸光度存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，即在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在此波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比關(guān)系，因此利用這一性質(zhì)可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定。該方法迅速、簡(jiǎn)便，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，可測(cè)定濃度為0.1～1.0mg／mL的蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)含量。

5.菠蘿蛋白酶的純度測(cè)定

冷凍干燥是指通過(guò)升華的方法從凍結(jié)的生物產(chǎn)品中去掉水分或其他溶劑的過(guò)程。升華是指溶劑（如水）像干冰一樣，不經(jīng)過(guò)液態(tài)，從固態(tài)直接變?yōu)闅鈶B(tài)的過(guò)程。冷凍干燥得到的產(chǎn)物稱為凍干物。傳統(tǒng)的干燥會(huì)引起材料皺縮，破壞細(xì)胞，在冷凍干燥的過(guò)程中樣品的結(jié)構(gòu)不會(huì)被破壞，因?yàn)楣腆w成分被在其位置上的冰支持著。在冰升華時(shí)，它會(huì)在干燥的剩余物質(zhì)里留下孔隙，這樣就保留了產(chǎn)品的生物和化學(xué)結(jié)構(gòu)及其活性的完整性。

在實(shí)驗(yàn)室中，冷凍干燥有很多不同的用途，它在許多生物化學(xué)與制藥應(yīng)用中是不可缺少的，它被用于獲得可長(zhǎng)時(shí)期保存的生物材料，如酶、血液與藥品，除長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性以外，它還保留了其固有的生物活性與結(jié)構(gòu)。冷凍干燥能得到干燥狀態(tài)的樣品，使樣品成分穩(wěn)定，也不需改變樣品的化學(xué)成分，是理想的分析輔助手段。

實(shí)訓(xùn)材料

新鮮菠蘿50g。

實(shí)訓(xùn)試劑

1.鹽析粗酶提取液

（1）0.1mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH＝7.8）200mL。

（2）0.2%的單寧溶液：取0.2g單寧加入100mL蒸餾水中溶解。

（3）固體硫酸銨。

（4）5%苯甲酸鈉溶液，10%EDTA-Na，5%的維生素C溶液。

2.測(cè)酶活性試劑

（1）1%酪蛋白溶液（pI＝4.8）50mL：加0.5g酪蛋白（進(jìn)口裝）于50mL 0.1mol／L的PBS（pH＝7.8）中，在50～55℃水浴條件下溶解，不停攪拌，約需1h才能溶解。

（2）激活劑（0.5%硫代硫酸鈉溶液）：取0.5g硫代硫酸鈉加100mL蒸餾水溶解。

（3）5%三氯乙酸（TCA）50mL。

實(shí)訓(xùn)器材

（1）榨汁機(jī)（或家庭用的電力攪拌器）。

（2）離心機(jī)（冷凍式或非冷凍式）。

（3）752型紫外分光光度計(jì)。

（4）恒溫水浴鍋。

（5）電子分析天平。

（6）托盤(pán)天平。

（7）剪刀、紗布。

（8）冰箱。

（9）真空泵和冷凍干燥機(jī)。

（10）濾紙、pH值試紙。

（11）玻璃器皿：試管、燒杯（100mL、200mL）、吸管、玻璃棒、移液管或移液器（5mL、1mL、0.5mL）、漏斗、量筒（100mL）、培養(yǎng)皿。

實(shí)訓(xùn)步驟

1.粗酶提取

粗酶提取的步驟如下。

新鮮菠蘿（每一組）50g＋50mL　0.1mol／L　PBS（pH＝7.8）

↓

榨汁機(jī)攪拌

↓

用2～4層紗布過(guò)濾于燒杯中

↓

加5%苯甲酸鈉溶液1mL，攪勻，用于防腐，分裝于離心管（50mL）

↓

平衡離心（4　000r／min，15min）

↓

棄沉淀，取上清液，量體積，倒入小燒杯，

在攪拌條件下，加入10%EDTA-Na　4mL、5%的維生素C溶液1mL

↙　　　　　　　　　　　　　　　↘

緩慢加入6g固體硫酸銨（形成的硫

酸銨溶液的飽和度小于30%）　加入0.2%的單寧溶液4mL

↘　　　　　　　　　　　　　　　↙

邊加邊攪拌，倒入離心管（每組1～2支離心管）

↓

離心管在4℃下放置1.5h

↓

平衡離心（4　000r／min，15min）

↓

取沉淀，再加0.1mol／L　PBS（pH＝7.8）8mL溶解，如果不能完全溶解，平衡后離心（4　000r／min，10min），棄沉淀，取上清液（酶液），進(jìn)行酶活性測(cè)定

2.酶活性測(cè)定方法

酶活性測(cè)定時(shí)各試劑的加入量和順序如表4-1所示。

表4-1　酶活性測(cè)定數(shù)據(jù)表

酶活性單位：在上述條件下（37℃，酶促反應(yīng)10min），每10min吸光度變化0.01的酶含量稱為1個(gè)酶活性單位（U）。計(jì)算公式： 1mL酶液的酶活性單位（U）＝［（A₁＋A₂）／2-A₀］／0.01×0.1

3.酶的含量測(cè)定

取3支試管，編號(hào)，按表4-2加入試劑。

表4-2　酶含量測(cè)定記錄表

將上述3支試管中物質(zhì)混勻，用紫外分光光度計(jì)在280nm、260nm波長(zhǎng)下，以空白管調(diào)零，測(cè)定樣品的吸光度。

按下式計(jì)算酶的質(zhì)量濃度：

酶的質(zhì)量濃度（mg／mL）＝1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀

式中：A₂₈₀為酶在280nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度；

A₂₆₀為酶在260nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度。

4.酶的純度鑒定

利用真空冷凍干燥法除去酶液中的水分，得到酶的干粉狀成品，計(jì)算酶的純度。

（1）檢查系統(tǒng)是否清潔和干燥，真空泵與冷凍干燥機(jī)是否連接，接通電源，檢查排氣口、冷凍管的密封性。

（2）加樣：將樣品置于冷凍艙里的隔板上，關(guān)閉密封管開(kāi)關(guān)。

（3）冷凍：打開(kāi)冷凍開(kāi)關(guān)，等待20～30min，直到冷凍艙的溫度低于-40℃。

（4）抽真空：打開(kāi)真空泵開(kāi)關(guān)，等待20～30min，直到系統(tǒng)壓力低于10Pa。

（5）監(jiān)控過(guò)程：確保系統(tǒng)參數(shù)（冷凍溫度、真空壓力）在正常范圍內(nèi)，定期檢查冷凍艙中的結(jié)冰情況，決定是否要除霜；觀察樣品是否干燥完全，一般干燥過(guò)程至少需要24h，具體時(shí)間通過(guò)目測(cè)而定。

（6）關(guān)閉系統(tǒng)：關(guān)閉總開(kāi)關(guān)，接上排氣管或打開(kāi)密封管開(kāi)關(guān)以解除真空狀態(tài)。關(guān)閉真空開(kāi)關(guān)，關(guān)閉冷凍開(kāi)關(guān)，取出樣品，稱重，記錄數(shù)據(jù)。

按照下列公式計(jì)算：

酶的純度＝（酶的質(zhì)量／成品的質(zhì)量）×100%

注意事項(xiàng)

（1）在用固體硫酸銨鹽析時(shí)，要邊加邊攪拌，注意控制硫酸銨的濃度，避免其他蛋白質(zhì)混入發(fā)生沉淀，影響酶的純度，增加后續(xù)分離純化的難度。

（2）在進(jìn)行酶提取時(shí)，要注意提取過(guò)程的溫度控制，在整個(gè)實(shí)訓(xùn)過(guò)程中，都要將酶液樣品置于4℃環(huán)境下，防止酶失活。

（3）在酶液保存時(shí)要注意冰結(jié)晶會(huì)造成物理剪切及蛋白質(zhì)變性，應(yīng)避免酶的反復(fù)凍融，如果酶需要凍存，應(yīng)分裝成小管后凍存。

（4）在進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，要避免其他蛋白質(zhì)或酶的污染，避免溶液劇烈振蕩，避免溶液中混入蛋白質(zhì)變性劑。

思考題

（1）如何防止酶在分離純化過(guò)程中變性？

（2）如何提高實(shí)訓(xùn)中酶的含量和純度？

（3）通過(guò)實(shí)訓(xùn)比較利用固體硫酸銨和單寧兩種提取方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。