實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目三　酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原

學(xué)習(xí)目標(biāo)

【知識(shí)目標(biāo)】

（1）能夠迅速而準(zhǔn)確地陳述酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原的操作要點(diǎn)。

（2）能用自己的語(yǔ)言描述酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原的原理。

（3）能夠準(zhǔn)確鑒別乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)的結(jié)果，并能說(shuō)明其臨床意義。

【能力目標(biāo)】

（1）能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)正確完成乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)的各步操作內(nèi)容，做到步驟正確、動(dòng)作連貫協(xié)調(diào)、內(nèi)容全面無(wú)遺漏。

（2）能熟練使用酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、微量加樣器。

（3）能夠理解乙型肝炎疫苗有效成分是乙型肝炎病毒表面抗原的原因。

（4）能夠熟練說(shuō)出乙型肝炎的五項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，準(zhǔn)確判斷“小三陽(yáng)”及“大三陽(yáng)”。

案例引導(dǎo)

患者，男，30歲，近期經(jīng)常感覺(jué)右肋下不適、隱隱作痛，全身倦怠、乏力，食欲減退，感到惡心、厭油，食用油膩食品后出現(xiàn)腹瀉。有時(shí)感覺(jué)低熱。檢查結(jié)果顯示：肝功能檢查中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）為56U/L（正常值0～40U/L）；乙型肝炎五項(xiàng)檢查中HBsAg（＋），HBsAb（－），HBeAg（＋），HBeAb（－），HBcAb（＋），其他肝炎病毒血清指標(biāo)未見(jiàn)異常。請(qǐng)結(jié)合患者癥狀及檢查結(jié)果作出初步診斷。

（提示：急性乙型肝炎）

【實(shí)驗(yàn)原理】

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫技術(shù)。

ELISA法的基本原理如下：使抗體（抗原）結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，稱為包被。再使抗體（抗原）與某種酶結(jié)合成酶標(biāo)抗體（抗原），這種酶標(biāo)抗體（抗原）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在檢測(cè)時(shí)，將受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗體（抗原）按不同的步驟與固相載體表面的抗體（抗原）發(fā)生反應(yīng)，生成抗體（抗原）－待測(cè)抗原（抗體）－酶標(biāo)記抗體（抗原）復(fù)合物，最后再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。待測(cè)抗原（抗體）的量與有色產(chǎn)物呈正比，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的產(chǎn)物顏色深淺進(jìn)行定性分析，也可借助于光吸收率來(lái)計(jì)算抗原（抗體）的量進(jìn)行定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。在上述過(guò)程中，酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原抗體免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次。因此，實(shí)驗(yàn)時(shí)可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)進(jìn)行二抗、三抗的免疫反應(yīng)。

酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)合的產(chǎn)物，是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑。它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，因而顯示出生物放大作用。制備酶結(jié)合物必須符合高純度、高活性、高單價(jià)3個(gè)條件。其中的酶應(yīng)具有性能穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)易得、底物無(wú)色、產(chǎn)物顯色、便于檢測(cè)的特點(diǎn)。常用的酶有堿性磷酸酯酶、辣根過(guò)氧化物酶，葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。它們均可催化相應(yīng)的無(wú)色底物，產(chǎn)生有色產(chǎn)物，并有特定的光吸收峰。終止酶促反應(yīng)后，底物不再改變。

按非均相酶免疫測(cè)定法可將ELISA分為多種類(lèi)型，但常用的有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙抗原夾心法等。

乙型肝炎病毒（HBV）為一種DNA病毒，外形似一個(gè)大球狀顆粒，其外層是由病毒蛋白組成的雙層外殼，內(nèi)部是一個(gè)含DNA分子的核心。在HBV外殼與核衣殼構(gòu)成的囊膜之間存在乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），在核衣殼與核心間存在乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）。當(dāng)HBV侵染肝臟細(xì)胞后，HBsAg會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生HBsAb，HBsAb是機(jī)體感染HBV的一種血清學(xué)標(biāo)志。HBV在肝細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制病毒的外殼，并且復(fù)制的量比在肝細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的核心多，過(guò)剩的外殼釋放入血液中，在血清檢測(cè)時(shí)可檢測(cè)到外殼中的HBsAg；HBcAg會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生HBcAb，HBcAb是HBV復(fù)制及機(jī)體血清具有傳染性的一種標(biāo)志，但HBcAg用來(lái)組裝病毒很少在血清中被檢測(cè)到；HBeAg刺激機(jī)體產(chǎn)生HBeAb，但HBeAg的本質(zhì)目前還不十分清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法檢測(cè)HBsAg。其測(cè)定原理是先將過(guò)量抗體包被于固相載體表面，加入待測(cè)抗原，同時(shí)加入多克隆抗－HBs－HRP（酶標(biāo)抗體）。當(dāng)標(biāo)本中存在HBsAg時(shí)，可進(jìn)行抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，生成抗體－待測(cè)抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物，即雙抗體夾心法（圖3－6）。最后加入該酶的底物（TMB）發(fā)生顯色反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深度進(jìn)行抗原的定性檢測(cè)。反之，則無(wú)顯色反應(yīng)。也可進(jìn)一步進(jìn)行定量分析，終止反應(yīng)，測(cè)定有色產(chǎn)物的吸光度，計(jì)算待測(cè)抗原的量。

圖3－6　雙抗體夾心法原理示意圖

主要反應(yīng)過(guò)程如下。

HBsAb（固相載體吸附）＋HBsA─→g固相免疫復(fù)合物

免疫復(fù)合物＋酶結(jié)合物（酶標(biāo)記HBsAb）─→雙夾心復(fù)合物

雙夾心復(fù)合物＋─→酶底物有色產(chǎn)物

【實(shí)驗(yàn)器材】

預(yù)包被聚苯乙烯微量反應(yīng)板（48孔或96孔），可調(diào)式微量吸液器（200μL），封口膜，37℃恒溫箱，酶標(biāo)儀，洗板機(jī)（或洗瓶）。

【藥品及試劑】

酶聯(lián)試劑，HBsAg陽(yáng)性對(duì)照，HBsAg陰性對(duì)照，PBST洗滌液，顯色劑A（Color A），顯色劑B（Color B），終止液（2mol/L H₂SO₄），血清。

【試劑配制】

用蒸餾水或去離子水對(duì)濃縮液進(jìn)行20倍稀釋即得PBST洗滌液。

其余為相應(yīng)試劑盒提供。

操作流程

【操作步驟】

1.編號(hào)

本實(shí)驗(yàn)在預(yù)包被好HBsAb的聚苯乙烯微量反應(yīng)板中進(jìn)行。（聚苯乙烯微量反應(yīng)板：96孔和48孔兩種規(guī)格；含有可拆換聚苯乙烯微孔條，每條含有12個(gè)加樣孔，每個(gè)孔都預(yù)包被了HBsAb）將微孔條固定在支架上，并將各孔編號(hào)（1為空白對(duì)照孔，2為陽(yáng)性對(duì)照孔，3為陰性對(duì)照孔，從4孔開(kāi)始作為樣本檢測(cè)孔，每人作一個(gè)待測(cè)樣本）。

2.加樣

分別在相應(yīng)微孔中加入空白對(duì)照（正常血清）、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、待測(cè)血清各50μL。

3.加酶

分別在各孔加入酶聯(lián)試劑50μL（用辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的HBsAb），混勻，用手在一個(gè)平面上左右前后振蕩，注意不可用力過(guò)大，避免孔內(nèi)液體振出。

4.溫育

將反應(yīng)板置于37℃恒溫箱中60min，使抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)充分。

5.洗滌

用PBST洗滌液充分洗滌5次，每次均需控干。

6.顯色

每孔加顯色劑A、B各50μL，混勻，37℃時(shí)暗置15～20min，使固相載體上結(jié)合的雙夾心復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。

7.終止

每孔加終止液50μL，混勻。

8.檢測(cè)

用酶標(biāo)儀在450/630nm雙波長(zhǎng)下，檢測(cè)各孔吸光度值。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

1.初步判定結(jié)果

通過(guò)對(duì)檢測(cè)孔顏色與陽(yáng)性顏色、陰性顏色對(duì)照比較后，得出結(jié)果。

2.定量分析

用酶標(biāo)儀檢測(cè)雙波長(zhǎng)450/630nm，測(cè)定各孔的OD值，并計(jì)算、判斷結(jié)果。

臨界值＝陰性對(duì)照孔OD平均值×2.1

樣品OD值/臨界值≥1，為HBsAg陽(yáng)性；

樣品OD值/臨界值＜1，為HBsAg陰性。

【注意事項(xiàng)】

（1）保存的血清切忌反復(fù)凍融，以免降低血清中抗體或抗原的免疫學(xué)活性。

（2）將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，待平衡至室溫后（約30min）方可開(kāi)啟使用。

（3）加樣時(shí)切忌振蕩或相互污染。

（4）洗滌要充分，每次洗滌要控干。

（5）為使顯色反應(yīng)便于比較，顯色后置于室溫暗處的時(shí)間應(yīng)一致，終止反應(yīng)3～5 min后應(yīng)立即比色。必要時(shí)可設(shè)陽(yáng)性對(duì)照，以固定顯色及終止時(shí)間。

（6）待測(cè)抗原與酶標(biāo)抗體應(yīng)具有相同的免疫特異性，否則無(wú)法結(jié)合。

（7）注意微量加樣器的使用及如何針對(duì)不同的吸液量來(lái)選擇不同量程的微量加樣器。

（8）注意酶標(biāo)儀的使用原理及操作方法。

【實(shí)驗(yàn)意義】

1.正常值

樣品OD值/臨界值≥1，為HBsAg陽(yáng)性；

樣品OD值/臨界值＜1，為HBsAg陰性。

2.意義

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無(wú)癥狀乙型肝炎病毒攜帶者（HBsAg攜帶者）超過(guò)2.8億，我國(guó)約占1.3億。主要通過(guò)血液、母嬰和性接觸進(jìn)行傳播。

感染乙型肝炎病毒后常分為以下幾種類(lèi)型。①乙型肝炎病毒攜帶者：沒(méi)有癥狀和體征，肝功能、肝膽脾B超等檢查長(zhǎng)期正常，乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性，不論是“大三陽(yáng)”或是“小三陽(yáng)”，也不論HBV－DNA陽(yáng)性或陰性，均稱為乙型肝炎病毒攜帶者，占乙型肝炎感染者的大多數(shù)。②急性乙型肝炎：病程在半年內(nèi)稱為急性乙型肝炎，一般發(fā)病較急，有輕重不等的癥狀，多數(shù)人表面抗原多在半年內(nèi)消失，少數(shù)可轉(zhuǎn)變成慢性乙型肝炎。③慢性乙型肝炎：病程超過(guò)半年稱為慢性乙型肝炎，可有輕重不同的癥狀，遷延不愈，反復(fù)發(fā)作。④重型乙型肝炎：病情發(fā)展迅速，癥狀很重，需入院積極治療，否則可危及生命。

乙型肝炎主要有以下臨床表現(xiàn)：常感到乏力、體力不支，容易疲勞，打不起精神；另外，肝臟作為重要的消化器官，分泌的膽汁是食物消化所必需的。患者患病時(shí)，膽汁分泌減少，影響食物的消化和吸收，因此，乙型肝炎患者常出現(xiàn)食欲不振、惡心、厭油、上腹部不適、腹脹等癥狀。肝臟內(nèi)部缺乏痛覺(jué)神經(jīng)，因此，乙型肝炎一般沒(méi)有劇烈的疼痛。但肝的表面有一層很薄的膜，稱為肝包膜，肝包膜上有痛覺(jué)神經(jīng)分布，當(dāng)肝臟發(fā)炎腫大時(shí)，肝包膜緊張，痛覺(jué)神經(jīng)受刺激，因而部分患者可有右上腹、右季肋部不適，隱痛感。肝臟是膽紅素代謝的中樞，患乙型肝炎時(shí)，由于膽紅素的攝取、結(jié)合、分泌、排泄等障礙，血液中膽紅素濃度增高，所以有些乙型肝炎患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的黃疸。黃疸是由于膽紅素從尿液排出，使尿液顏色變深，有時(shí)還可引起鞏膜、皮膚黃染。過(guò)多的膽汁酸沉積于皮膚，刺激末梢神經(jīng)，引起皮膚瘙癢。有些患者還會(huì)出現(xiàn)一些肝外表現(xiàn)，如有些慢性乙型肝炎患者面色晦暗或黝黑，稱為肝病面容，這可能是由于內(nèi)分泌失調(diào)，皮膚色素沉著引起的。手掌大、小魚(yú)際顯著充血稱為肝掌。面部、頸部、前胸和手背的皮膚上出現(xiàn)一簇呈放射狀擴(kuò)張的毛細(xì)血管稱為蜘蛛痣。

乙型肝炎病毒是一種由一個(gè)囊膜和一個(gè)含有DNA分子的核衣殼組成的病毒顆粒，游離的核衣殼只能在肝細(xì)胞核內(nèi)觀察到。血中病毒濃度以急性肝炎潛伏期后期為最高，在疾病發(fā)生后迅速下降。病毒表面含有HBsAg。目前，已可從感染HBV患者的血清中及感染肝臟提純的病毒核心中分離出環(huán)狀雙股DNA，從而確定HBV屬DNA病毒，在臨床實(shí)踐中可以將檢測(cè)血清HBV－DNA的Copy數(shù)的方法廣泛用于乙型肝炎輔助診斷中，是HBV感染最直接、特異性強(qiáng)和靈敏性高的指標(biāo)。

HBsAg作為乙型肝炎五項(xiàng)檢查（俗稱“兩對(duì)半”）的第一項(xiàng)指標(biāo)在臨床中應(yīng)用廣泛。乙型肝炎五項(xiàng)包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。所謂“大三陽(yáng)”是指HBsAg、HBeAg和HBcAb檢測(cè)均是陽(yáng)性。一般認(rèn)為，“大三陽(yáng)”傳染性相對(duì)較強(qiáng)，同時(shí)演變成慢性乙型肝炎的可能性也比較大。所謂“小三陽(yáng)”是指HBsAg、HBeAb和HBcAb檢測(cè)均是陽(yáng)性。它和“大三陽(yáng)”的區(qū)別是后者E抗原陽(yáng)性，它通常是由“大三陽(yáng)”轉(zhuǎn)變而來(lái)，是人體針對(duì)E抗原產(chǎn)生了一定程度的免疫力。一般認(rèn)為“小三陽(yáng)”的傳染性較小。

HBsAg陽(yáng)性表明受試者受到乙型肝炎病毒感染。目前，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清HBsAg具有很高的準(zhǔn)確度，HBsAg陽(yáng)性已作為HBV感染的診斷依據(jù)。同時(shí)，HBsAg陰性也成為獻(xiàn)血者篩檢合格的指標(biāo)。

鑒于乙型肝炎的高傳染性，目前尚缺乏高效的治愈方法，接種乙型肝炎疫苗是預(yù)防乙型肝炎病毒感染的最有效方法。目前，乙型肝炎疫苗的有效成分主要是HBsAg，通常采用基因工程的手段制備，大大降低了成本。乙型肝炎疫苗全程接種共3針，按照0、1、6個(gè)月程序接種。疫苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種抗體存在于人的體液之中，乙型肝炎病毒一旦出現(xiàn)，抗體會(huì)立即作用，將其清除，阻止感染，并不會(huì)傷害肝臟，從而使人體具有預(yù)防乙型肝炎的免疫力，從而達(dá)到預(yù)防乙型肝炎感染的目的。有些人抗體產(chǎn)生較晚，被稱為應(yīng)答遲緩。對(duì)此可加注1～2針，或者重新接種疫苗，并且適當(dāng)增加劑量。乙型肝炎疫苗接種后產(chǎn)生的抗體水平隨時(shí)間逐漸下降，我國(guó)眾多醫(yī)學(xué)者建議免疫后3年內(nèi)加強(qiáng)1次為好。

能力檢測(cè)

一、單項(xiàng)選擇題

1.下列關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附法的描述錯(cuò)誤的是（　　）。

A.它是在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫技術(shù)

B.利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)

C.可根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)進(jìn)行二抗、三抗的免疫反應(yīng)

D.在某些檢測(cè)中利用酶促反應(yīng)的生物放大作用

E.在雙抗體夾心法中可以檢測(cè)半抗原

2.在受HBV感染的人體血清中不能檢測(cè)到下列哪項(xiàng)指標(biāo)？（　　）

A.HBsAg　　B.HBsAb　　C.HBrAg　　D.HBeAb　　E.HBeAg

3.下列哪項(xiàng)是抗乙型肝炎病毒疫苗的有效成分？（　　）

A.HBeAg　　B.HBsAb　　C.HBsAg　　D.HBcAb　　E.HBcAg

4.下列哪項(xiàng)指標(biāo)陰性可以作為獻(xiàn)血者篩檢合格的指標(biāo)之一？（　?。?/p>

A.HBeAb　　B.HBcAb　　C.HBeAg　　D.HBsAb　　E.HBsAg

5.在雙抗體夾心法檢測(cè)血清HBsAg過(guò)程中，下列哪步操作有酶促反應(yīng)發(fā)生？（　　）

A.加酶　　B.溫育　　C.洗滌　　D.顯色　　E.終止