實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目十五　酵母蛋白質(zhì)和RNA的提取

學(xué)習(xí)目標(biāo)

【知識(shí)目標(biāo)】

（1）能用自己的語言描述酵母蛋白質(zhì)和RNA提取的原理。

（2）能夠迅速而準(zhǔn)確地陳述酵母蛋白質(zhì)和RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)。

（3）能夠準(zhǔn)確鑒別酵母蛋白質(zhì)和RNA提取的結(jié)果，并能說明其意義。

【能力目標(biāo)】

（1）能夠正確完成酵母蛋白質(zhì)和RNA提取的各項(xiàng)操作內(nèi)容，做到步驟正確、動(dòng)作連貫協(xié)調(diào)、內(nèi)容全面無遺漏。

（2）能夠正確分析酵母蛋白質(zhì)和RNA提取的結(jié)果。

案例引導(dǎo)

患者，男，42歲，近期出現(xiàn)全身乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、厭油、腹脹、肝區(qū)痛、尿色加深等癥狀。肝功能檢查ALT升高。HCV－RNA檢查呈陽性。根據(jù)所學(xué)知識(shí)，對(duì)患者作出診斷。

（提示：急性丙型肝炎）

【實(shí)驗(yàn)原理】

酵母細(xì)胞富含蛋白質(zhì)和核酸。用稀堿液（0.2%的氫氧化鈉）處理酵母細(xì)胞使細(xì)胞裂解，離心收集上清液，得到酵母核蛋白提取液。用鹽酸調(diào)節(jié)提取液的pH值至3.0（核蛋白的等電點(diǎn)），核蛋白溶解度下降導(dǎo)致大量析出，離心收集沉淀物為酵母蛋白質(zhì)粗制品。

酵母核蛋白是一種結(jié)合蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)與核酸的復(fù)合物。酵母核酸主要是RNA（含量為干菌體的2.67%～10.0%），DNA含量較少，僅為0.03%～0.516%。如設(shè)法使酵母核蛋白中的蛋白質(zhì)與核酸分離并除去蛋白質(zhì)和DNA，就可得到較純的RNA制品。這可通過以下操作完成：將核蛋白制品溶于含十二烷基磺酸鈉（SDS）的緩沖液中，加等體積的水飽和酚，劇烈振蕩后離心，將溶液分成兩層，上層為水相，含有RNA；下層為酚相，變性蛋白及DNA存在于酚相及兩相界面處。吸出水相并加乙醇即可沉淀出酵母RNA。若用氯仿－異戊醇進(jìn)一步處理RNA制品，則可獲得純度更高的RNA。

【實(shí)驗(yàn)器材】

離心機(jī)，干燥箱，恒溫水浴箱，真空干燥器，天平，751型分光光度計(jì)，冰箱，量筒（50mL），蒸發(fā)皿，燒杯（50mL、100mL），Eppendorf管（1.5mL），精密試紙（pH值測(cè)定范圍為0.5～5.0）。

【藥品及試劑】

0.2%NaOH溶液，6mol/L鹽酸溶液，95%乙醇，SDS緩沖液：0.3%SDS，飽和酚液，氯仿－異戊醇液，含2%乙酸鉀的95%乙醇溶液，無水乙醇，乙醚，鮮酵母或干酵母粉。

【試劑配制】

（1）SDS緩沖液：0.3%SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L乙酸鈉，用乙酸將pH值調(diào)到5.0。

（2）氯仿－異戊醇液：24∶1（體積比）。

操作流程

【操作步驟】

1.酵母核蛋白的提取

稱取鮮酵母30g或干酵母粉5g，放入100mL的燒杯中。加入40mL 0.2% NaOH溶液，在20～40℃水浴環(huán)境下攪拌30～60min后，在轉(zhuǎn)速為4000r/min條件下離心10min，取上清液倒入50mL的燒杯中，并將燒杯置于放有冰塊的250mL的大燒杯中冷卻，待冷卻至10℃以下時(shí)，用6mol/L HCl小心地調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.0左右。隨著pH值下降，溶液中的白色沉淀物逐漸增加，到pH值為等電點(diǎn)時(shí)沉淀最多（注意嚴(yán)格控制pH值）。pH值調(diào)好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。將此懸浮液以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，倒掉上清液。將沉淀物轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿內(nèi)，放入干燥箱中干燥后稱重，即是酵母核蛋白粗品。

2.苯酚法提取酵母RNA

取上述核蛋白研碎，加10mL SDS－緩沖液，使之成勻漿，倒入Eppendorf管（略少于管容積的一半），室溫下靜置10min，再加等體積的飽和酚液，室溫下劇烈振蕩5min后置于冰浴中分層，在轉(zhuǎn)速為4000r/min的條件下離心10min，吸出上清液，轉(zhuǎn)入新的Eppendorf管，加兩倍體積95%乙醇（含2%乙酸鉀），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，沉淀用少許無水乙醇和乙醚各洗一次，各迅速離心1min，保留沉淀。傾去乙醚后，減壓真空干燥，準(zhǔn)確稱重，記錄（或?qū)⒊恋砣苡谏倭?mol/L NaCl溶液中，4℃時(shí)保存?zhèn)溆茫?/p>

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

1.計(jì)算核蛋白提取率

核蛋白提取率（%）＝核蛋白質(zhì)量（g）/酵母質(zhì)量（g）×100%

2.RNA含量測(cè)定

將干燥后或保留沉淀的RNA配制成濃度為10～50μg/mL的溶液，在751型分光光度計(jì)上測(cè)定其260nm處的吸光度，按下式計(jì)算RNA含量：

3.計(jì)算RNA提取率

【注意事項(xiàng)】

利用等電點(diǎn)控制核蛋白析出時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制pH值。

【實(shí)驗(yàn)意義】

RNA作為遺傳物質(zhì)之一，它的提取和分析都有著重要的意義，這些對(duì)于研究相關(guān)遺傳疾病起著重要的作用。

能力檢測(cè)

一、單項(xiàng)選擇題

1.在生物體系中下列信息傳遞方式尚無證據(jù)的是（　　）。

A.DNA→RNA　　　B.DNA→蛋白質(zhì)

C.蛋白質(zhì)→RNA　D.RNA→DNA

E.以上都不是

2.下列關(guān)于DNA指導(dǎo)的RNA合成的敘述中哪一項(xiàng)是錯(cuò)誤的？（　?。?/p>

A.只有在DNA存在時(shí)，RNA聚合酶才能催化生成磷酸二酯鍵

B.轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶需要引物

C.RNA鏈的合成方向是5′→3′

D.大多數(shù)情況下只有一股DNA作為RNA的模板

E.合成的RNA鏈沒有環(huán)狀的

3.下列關(guān)于RNA的生物合成，哪一項(xiàng)是正確的？（　?。?/p>

A.轉(zhuǎn)錄過程需要RNA引物

B.轉(zhuǎn)錄生成的RNA都是翻譯模板

C.蛋白質(zhì)在細(xì)胞漿中合成，所以轉(zhuǎn)錄也在細(xì)胞漿中進(jìn)行

D.DNA雙鏈中一股單鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄模板

E.合成方向是3′→5′

4.能特異性抑制原核生物RNA聚合酶的是（　?。?。

A.利福平　　B.鵝膏蕈堿　　C.假尿嘧啶　　D.亞硝酸鹽　　E.青霉素

5.病毒的核心是（　?。?。

A.核酸　　B.蛋白質(zhì)　　C.多肽　　D.脂類　　E.糖蛋白