大量臨床實驗研究表明ras基因的突變和多種人體癌癥直接相關(guān)（表8-2），但要搞清楚ras基因在癌變過程中的作用至少有兩大困難：①當(dāng)時許多腫瘤的病理基礎(chǔ)尚未確切了解；②不可能用人體做癌變的實驗研究。為此，必須建立一個能在基因分子結(jié)構(gòu)水平上研究ras基因和癌變關(guān)系的動物實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

早在1975年古利諾（P.M.Gullino）等就報道過，化學(xué)誘變劑N-亞硝基-N-甲基脲（NMU）可誘發(fā)大鼠的乳腺癌。1983年，巴瓦西德實驗室的蘇庫瑪（S.Sukuma）等發(fā)現(xiàn)用NMU處理Buf/N大鼠一次即可誘發(fā)乳腺癌，并在誘發(fā)的癌細(xì)胞中檢出了有惡性轉(zhuǎn)化活性的H-ras-l基因。很重要的一點是這些由誘變性致癌物激活的H-ras-l基因，具有與人體腫瘤中所發(fā)現(xiàn)的幾乎完全一樣的激活機(jī)制。正是這一點，使這個系統(tǒng)成為研究人癌基因轉(zhuǎn)化激活的良好實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

為了探索ras基因在多階段致癌過程中所起的作用，必須先確定ras基因惡轉(zhuǎn)活化發(fā)生的時間段。在NMU誘發(fā)大鼠乳腺癌這個系統(tǒng)中，對于確認(rèn)癌變中ras激活是否發(fā)生于啟動階段，有兩個有利條件。①大量的研究已經(jīng)證實NMU可專一性地誘發(fā)G到A這個轉(zhuǎn)換突變，專一程度可等于或大于99%。扎布爾（H.Zarbl）在1985年還證實，所有NMU誘發(fā)的大鼠乳腺癌中活化的H-ras基因，都在12號密碼子的第二個核苷酸，發(fā)生了G到A的轉(zhuǎn)換突變；相反，另一種致癌物7，12-甲基苯并蒽（DMBA）誘發(fā)的乳腺癌中的活化H-ras基因，誘發(fā)的并不是G到A轉(zhuǎn)換。對比NMU和DMBA產(chǎn)生的不同結(jié)果，可以較有把握地認(rèn)為NMU是通過引起G到A轉(zhuǎn)換而引起H-ras基因惡轉(zhuǎn)活化的直接原因。②NMU在生理條件下是極不穩(wěn)定的，經(jīng)測定靜脈注入的NMU半數(shù)失活時間只有20 min，這表明NMU在大鼠體內(nèi)的作用時間僅有幾個小時。就在這段時間內(nèi)，NMU啟動了誘變致癌過程。這些實驗研究從不同的側(cè)面說明，如果NMU引起的由G到A的轉(zhuǎn)換造成了誘發(fā)乳腺癌中H-ras基因的突變，那么這種突變引起的基因活化是發(fā)生在癌變啟動階段的。

圖8-9　NMU誘發(fā)的大鼠乳腺癌中H-ras基因突變的MnlⅠ多態(tài)檢測方法

（a）檢測原理，圓形黑點是Mnl Ⅰ切點，中間有紅色的圓點是因突變而失去的Mnl Ⅰ切點，它涉及12、13兩個密碼子；（b）檢測結(jié)果：a為正常乳腺細(xì)胞DNA片段；b、c為經(jīng)NMU誘變產(chǎn)生的乳腺癌細(xì)胞DNA片段（改自E.Santos）

NMU誘發(fā)H-ras基因第一個外顯子中第12號密碼子的第二個核苷酸由G轉(zhuǎn)換為A，會使H-ras-l基因失去一個限制性內(nèi)切酶MnlⅠ的識別和切割序列GAGG，造成有診斷意義的限制性片段長度多態(tài)現(xiàn)象（RFLP）。正常的H-ras-l基因的第一個外顯子序列分屬兩個限制性內(nèi)切酶Mnl Ⅰ切割片段，長度分別為206 bp和74 bp（圖8-9），惡轉(zhuǎn)活化的H-ras基因的相應(yīng)片段由于失去一個Mnl Ⅰ切點，只能產(chǎn)生一個長度為280 bp的Mnl Ⅰ片段。利用一個120 bp的HPaⅡ/SacⅠ片段作為印跡雜交的探針，以Mnl Ⅰ為診斷用內(nèi)切酶即可進(jìn)行H-ras的RFLP分析，扎布爾等用Mnl Ⅰ多態(tài)檢測法測定了用NMU誘發(fā)的三種大鼠品系的乳腺癌的DNA樣品58份，結(jié)果證實其中的48份（占83%）為Mnl Ⅰ多態(tài)陽性（表8-3）。在陽性反應(yīng)的DNA樣品中，又有36個（占75%）能引起NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。這表明NIH3T3細(xì)胞是具有惡轉(zhuǎn)活性的H-ras基因較為可靠的檢測系統(tǒng)。

作為對照，扎布爾又檢測了26份取自正常大鼠乳房細(xì)胞的DNA，結(jié)果無一出現(xiàn)Mnl Ⅰ切割片段的長度多態(tài)現(xiàn)象（表8-4）。此外，又做了6只患有非乳腺癌的大鼠的乳房細(xì)胞DNA分析，結(jié)果亦為Mnl Ⅰ多態(tài)陰性。

表8-4　NMU誘發(fā)的大鼠乳腺癌的H-ras的MnlⅠ多態(tài)檢測

*表示其中4只Buf/N和2只Sprague-Dawley大鼠的樣品取自非乳腺癌患鼠的正常乳房細(xì)胞。

為了進(jìn)一步證實NMU誘發(fā)的是G35到A（35位即12號密碼子第二號核苷酸的序號），可合成一個含19個核苷酸的寡核苷酸探針，將要探測的核苷酸設(shè)計在探針序列中間，兩側(cè)各有9個可與被檢DNA片段中相應(yīng)區(qū)段互補(bǔ)的核苷酸。例如，檢測G35到A變異可用下列寡核苷酸探針組合：

H19g35探針：5′-TGGGCGCTGG*AGGCGTGGG-3′

H 19 A35探針：5′-TGGGCGCTGA*AGGCGTGGG-3′

在適宜的雜交條件下，標(biāo)記的H 19g35探針能和來自正常細(xì)胞的相應(yīng)DNA酶切片段雜交形成互補(bǔ)雙鏈，但不能和來自NMU誘發(fā)的乳癌細(xì)胞中同樣的DNA酶切片段雜交。相反，標(biāo)記的H19 A35探針只能和NMU誘發(fā)的乳腺癌細(xì)胞中的相應(yīng)DNA片段形成雜合雙鏈，但與正常細(xì)胞的相應(yīng)DNA片段不能雜交。這個實驗證據(jù)非常有力地表明NMU確有特異性極高的誘發(fā)G到A突變的能力。

綜上所述，用NMU一次處理誘發(fā)大鼠乳腺癌是一個可以在分子水平分析癌基因Ha-ras的動物致癌模型。利用這個實驗?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)探明下列幾點。

（1）NMU誘變具有很高的專一性，對它誘發(fā)的大鼠乳腺癌講，誘變部位是Ha-ras-l基因的G35到A的轉(zhuǎn)換突變。

（2）Ha-ras基因的惡轉(zhuǎn)活化發(fā)生于癌變的起始階段。

（3）大鼠乳腺癌的Ha-ras基因的惡轉(zhuǎn)活化機(jī)制和人體中某些腫瘤中癌基因ras的活化機(jī)制是相同或相似的。因此利用這個模型可能進(jìn)行人類癌變的體內(nèi)分子遺傳學(xué)研究和分子病理學(xué)研究。