五、煙草漂浮育苗中TMV的快速檢測方法

煙草漂浮育苗中煙草花葉病毒（TMV）快速檢測是防治煙草病毒病技術(shù)體系——“四步法”中的第二步，即在第一步狠抓漂浮育苗的消毒等預防工作后，要求做好漂浮育苗病毒病的快速檢測工作。TMV快速檢測技術(shù)的步驟和方法如下：

1.漂浮苗隨機采樣方法

漂浮育苗采樣原則是，重點采樣檢測與普遍采樣檢測相結(jié)合，全州確立147個大棚群作普遍采樣檢測；對200個以上供2萬畝以上大田移栽的大棚育苗點作重點采樣檢測；對1000個以上供4000畝以上大田移栽的小棚育苗點作重點采樣檢測，歷史上發(fā)生花葉病的棚群作重點檢測；上年發(fā)生花葉病的棚群作重點檢測；對發(fā)生疑似癥狀的育苗棚作重點檢測。

2.大棚群采樣方法

大棚群根據(jù)要求隨機選取取樣棚，確定為取樣棚后對每個育苗池煙苗進行取樣，池內(nèi)采用“S”形五點隨機取樣法取樣，每池（200盤容量以上）隨機選取30盤煙苗，每盤取1個葉片（約一個大拇指大?。?，10個葉片裝入一個樣品袋，作為一個混合樣進行檢測，即每池取3個混合樣本進行檢測；每池（100～200盤容量）隨機選取20盤煙苗，每盤取1個葉片（約一個大拇指大小），10個葉片裝入一個樣品袋，作為一個混合樣進行檢測，即每池取2個混合樣本進行檢測；每池（100盤容量以下）隨機選取10盤煙苗，每盤取1個葉片（約一個大拇指大?。?0個葉片裝入一個樣品袋，作為一個混合樣進行檢測，即每池取1個混合樣本進行檢測。操作方法如示意圖6-1，2。

圖6-1　育苗池內(nèi)樣品采集示意圖

圖6-2　育苗小棚群樣品采集示意圖

3.小棚群采樣方法

小棚群以區(qū)（10～20個小棚為一個區(qū)）取樣單位，采用“S”形五點隨機取樣法進行取樣。確定為取樣小棚的以棚為取樣單位，每個小棚內(nèi)隨機選取10個苗盤，每盤取1個葉片（約一個大拇指大?。?，10個葉片裝入一個樣品袋，作為一個混合樣進行檢測，即每棚取1個混合樣本進行檢測。以后每次采樣均要以第一次采集棚池為準，樣品采集如示意圖2。

4.取樣方法、樣品編號規(guī)范及樣品裝袋規(guī)范

每株煙苗取4 cm²～5cm²（約拇指第一節(jié)大?。┑娜~片。因樣品量較大，為使檢測能順利進行，檢測采用統(tǒng)一樣品編號，例如：祥云縣禾甸鄉(xiāng)3號棚1號池4月18日采樣，編號為XY～HD～3～1～418。檢測采用統(tǒng)一樣品裝袋，如示意圖6-3。

圖6-3　樣品裝袋意圖

5.采樣注意事項

進入棚群必須用一次性塑料腳套（或塑料袋套腳），每采集完一個育苗池采集人員更換一次性手套（或洗手），同時要換一次性塑料腳套（或塑料袋），防止人為造成病毒傳播；在第一次采樣后，育苗池之間的苗盤不能交換，以便于檢測及分析最終試驗數(shù)據(jù)；建立取樣檔案，要包括大棚和育苗池分布示意圖及育苗池編號。

6.樣品處理流程

采集的樣品按照圖3的流程進行分類、檢測。各縣樣品經(jīng)統(tǒng)計整理后，先進行TAS～ELISA檢測。檢測結(jié)果為陽性的樣品繼續(xù)進行電鏡負染法復檢，陰性樣品抽取1%～5%的進行電鏡負染法復檢，最后分析得出檢測報告。操作流程如圖6-4。

圖6-4　樣品檢測流程圖

7.檢測方法

（1）電鏡負染色法

參照張仲凱等的方法進行待測樣品徒手切片粗汁液2%鉬酸銨（pH5.5）負染色，置于JEM100CX～Ⅱ型透射電子顯微鏡觀察至少30個視野以上，判定樣品中病毒相對含量。

（2）TAS～ELISA法

TAS～ELISA流程操作如下：

①TMV多抗血清（1:5000）加入酶標板（包被緩沖液稀釋），每孔100μl，37℃下放置2～3小時。

②PBST洗板3次，3 min/次，拍干。

③樣品加入病毒抽提緩沖液（約5～10倍）研磨樣品，加入酶標板，每孔100μl，4℃下放置過夜或37℃ 2小時。同上洗板。

④每孔加入200μl封閉緩沖液，37℃下放置30min。拋棄孔中液體，拍干。

⑤TMV單克隆抗體（1:10000）（PBST稀釋），加入酶標板，每孔100μl，37℃下放置1～2小時。同上洗板。

⑥羊抗鼠AP～IgG（1:10000）（PBST稀釋），加入酶標板，每孔100μl，37℃下放置1小時。同上洗板。

⑦用底物緩沖液溶解底物（1mg/ml），加入酶標板，每孔100μl，室溫（25℃）下至充分顯色（每孔加入50μl 1N NaOH終止顯色）。肉眼判別或酶標儀讀數(shù)。

8.檢測結(jié)果處理

（1）檢測結(jié)果分類標準

應用酶標儀進行檢測結(jié)果判別時，記錄酶標儀在405nm波長下酶標板每孔的OD數(shù)值，首先進行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，若空白孔出現(xiàn)明顯的顏色反應，或經(jīng)空白孔調(diào)零后，系統(tǒng)檢測出現(xiàn)大量的負值時，整個系統(tǒng)測定無效；每一樣品測定雙孔的OD值應基本一致，若兩孔測定值差別較大（一般指同一樣品相同稀釋度兩孔的OD值超過其均值的0.5～1.5倍范圍），該酶標板檢測結(jié)果無效。若陽性對照OD值低于或接近陰性對照OD值時，測定也無效。待測樣品OD值與陰性對照OD值檢測之比大于等于3時，待測樣品為強陽性，大于2時為陽性，小于2而大于1.8時為弱陽性，小于1.8而大于1.5時為疑似樣品，小于1.5為陰性。

對照電鏡檢測結(jié)果，大田實際發(fā)病情況可以進一步確定各等級帶毒情況為：“疑似”表示檢測樣品中最多有一個葉片初期感染病毒，但電鏡負染檢測未能觀察到典型病毒粒子，或者是由于取樣及檢測的誤差出現(xiàn)為OD值偏高；“弱陽性”表示檢測樣品中有1～2個葉片初期感染病毒，但電鏡負染檢測30個視野可以觀察到1～2個疑似病毒粒子；“陽性”表示檢測樣品中有1～2個葉片感染病毒，電鏡負染檢測30個視野可以觀察到2～3個病毒粒子；“強陽性”表示檢測樣品中有3～4個葉片感染病毒，電鏡負染檢測30個視野，每個視野可以觀察到2～3個病毒粒子。

（2）檢出棚群的處理

疑似及弱陽性樣品建議增加30倍取樣規(guī)模進一步進行帶毒率檢測，確證后再確定煙苗使用與否；對于陽性樣品要求重復采集5～10倍取樣規(guī)模進行復測，確證后建議關(guān)閉棚池；對于強陽性樣品，通過細致調(diào)查棚池的顯癥帶毒情況，建議關(guān)閉棚池。