第一節(jié)　PCR技術(shù)簡(jiǎn)史

對(duì)于核酸的研究已有100多年的歷史，20世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。H.Ghobind Khorana和他的同事于1971年最早提出了核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因”。但是，由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件的限制，基因測(cè)序、引物合成等方面的研究都存在一定的局限性，特別是還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的耐熱DNA聚合酶（thermostable DNA polymerase）等諸多因素，這個(gè)設(shè)想在當(dāng)時(shí)看來(lái)不大可能實(shí)現(xiàn)，并且很快被人遺忘。

1985年，美國(guó)PE－Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室的Kary Mullis和他的同事利用大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段成功地在體外擴(kuò)增了哺乳動(dòng)物基因，從而實(shí)現(xiàn)了Khorana的設(shè)想，發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR。其原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難；②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。因此，PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年，Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2小時(shí)后其殘留活性是原來(lái)的40%；②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶；③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度（2.0kb）。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏度也大大提高。為與大腸埃希菌聚合酶ⅠKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為T(mén)aq DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase，Taq pol）。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛地被應(yīng)用。