層析技術(shù)_生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

項(xiàng)目三　層析技術(shù)

層析技術(shù)（層析法）也稱為色譜法，因早期分離植物色素而得名。

一、基本原理

層析技術(shù)是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過(guò)固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。

二、相關(guān)基本概念

（1）固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑、凝膠、離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用。

（2）流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。在柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。

三、層析技術(shù)分類

（一）根據(jù)操作形式不同分類

1.柱層析

將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。

2.紙層析

用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的。

3.薄層層析

將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。

紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測(cè)分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品的分析、分離。

（二）根據(jù)流動(dòng)相存在狀態(tài)不同分類

分為氣相層析和液相層析。

（三）根據(jù)原理不同分類

1.吸附層析

吸附層析是最早建立的一種層析分離方法。當(dāng)混合物各組分隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相吸附時(shí)，在兩相界面不斷發(fā)生著吸附和解吸附過(guò)程，由于吸附劑對(duì)不同物質(zhì)具有不同吸附力，故能使各組分彼此分離。吸附包括物理吸附和化學(xué)吸附，常用硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺、聚苯乙烯、羥基磷灰石等作吸附劑，用液態(tài)烷、鹵代烷、酮、醇、醚、有機(jī)酸等作流動(dòng)相。

2.分配層析

利用混合物在兩相（固定相和流動(dòng)相）之間分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。

分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)（Kd）。分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此，可彼此分開。物質(zhì)在載體上的移動(dòng)速率可用R_f表示。

R_f＝色斑中心到原點(diǎn)中心的距離/溶劑前緣至原點(diǎn)中心的距離

物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，R_f值也是恒定的，因此可以根據(jù)R_f值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。

3.離子交換層析

離子交換層析是以離子交換劑為固定相，當(dāng)流動(dòng)相中帶電粒子流經(jīng)固定相時(shí)，將固定相中帶同種電荷的離子交換下來(lái)，而自身被固定結(jié)合。不同組分的離子交換能力不同，從而將各組分彼此分離。

離子交換劑包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖凝膠三類。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物以共價(jià)鍵形式結(jié)合，形成一個(gè)帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其他的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽(yáng)離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑能與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。洗脫液常用具有一定pH值的酸類、堿類或鹽類緩沖液。

4.凝膠層析

凝膠層析（分子篩層析）是當(dāng)生物大分子隨流動(dòng)相通過(guò)裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。

凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，且移動(dòng)速度快；比網(wǎng)孔直徑小的分子能不同程度地自由出入凝膠孔內(nèi)外，在層析柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢，據(jù)此可將分子大小及形狀不同的組分分離。洗脫液常用有機(jī)溶劑或具有一定pH值的鹽類緩沖液。

5.親和層析法

親和層析（affinity chromatography）是利用生物分子間專一的親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。

親和層析的分離原理就是將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)（配體）固定在不溶性載體上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。常用的載體有瓊脂糖、PAG等。將配體結(jié)合到載體的方法，一般是先將載體功能基活化，再與配體以共價(jià)鍵形式結(jié)合。當(dāng)流動(dòng)相中待分離的親和物流經(jīng)固定相時(shí)，與配體專一結(jié)合，其他雜質(zhì)隨流動(dòng)相洗滌下來(lái)，然后再用洗脫劑將親和物洗脫、收集。

層析分離技術(shù)具有分離效果好、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，與檢測(cè)系統(tǒng)和微機(jī)結(jié)合，還可以組成各種自動(dòng)化的分離、分析儀器，如高效氣相色譜儀、高效液相色譜儀等，這些儀器廣泛用于化學(xué)物質(zhì)和生物大分子的分離、分析。

6.高效液相色譜

（1）高效液相色譜儀：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）又稱作高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography），按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似，但需在色譜儀中進(jìn)行。高效液相色譜儀一般由溶劑槽、高壓泵、分析柱、進(jìn)樣器、檢測(cè)器、部分收集器、記錄儀、數(shù)據(jù)處理機(jī)等單元組成，有的還有梯度儀和流量測(cè)量裝置。

（2）高效液相色譜的特點(diǎn)及應(yīng)用：高效液相色譜是吸收了普通液相層析和氣相色譜的優(yōu)點(diǎn)，再經(jīng)過(guò)適當(dāng)改革發(fā)展起來(lái)的。它既有普通液相層析的功能（可在常溫下分離制備水溶性的物質(zhì)），又有氣相色譜的特點(diǎn)（即高壓、高速、高分辨率和高靈敏度）；它不僅適用于很多不易揮發(fā)、難熱分解物質(zhì)（如金屬離子、蛋白質(zhì)、肽類、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、單糖、寡糖和激素等）的定性和定量分析，而且也適用于上述物質(zhì)的制備和分離。特別是近年來(lái)出現(xiàn)一種與HPLC相近的快速蛋白液相色譜（fast protein liquid chromatography，簡(jiǎn)稱FPLC）能在惰性條件下，以極快的速度把復(fù)雜的混合物通過(guò)成百上千次層析分開。如果連續(xù)進(jìn)樣，一天內(nèi)可制出大量的欲純化物質(zhì)。

目前，HPLC在生物化學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

①對(duì)脂肪族低級(jí)醇、醛和酮，可用高效液相色譜法獲得很好分離；對(duì)于芳香族醇、醛和酮，或者含有芳香環(huán)、雜環(huán)等可吸收紫外光的醇、醛和酮，用高效液相色譜法分離最合適。

②氣相色譜法雖能分離烴類化合物，但它在分析相對(duì)分子質(zhì)量大和揮發(fā)性低的烴類化合物時(shí)受到限制，而高效液相色譜法卻可補(bǔ)償其不足。對(duì)于芳香烴及其衍生物用高效液相色譜法尤為合適。

③維生素是一類重要的藥物。高效液相色譜法用于分離無(wú)論是脂溶性的還是水溶性的維生素，其結(jié)果都比使用其他方法好。

④各種類型的甾族化合物均可用高效液相色譜法成功地分離。吸附色譜法、液－液分配色譜法和反相色譜法都可用來(lái)分離甾族化合物。

⑤用高效液相色譜法分離糖，通常不需要衍生化，在多數(shù)情況下也不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。分離糖可以使用吸附色譜法，如在硅膠柱上用甲酸乙酯∶甲醇∶水（6∶2∶1）為移動(dòng)相分離果糖、蔗糖、山梨糖和乳糖。

⑥在通常的高效液相色譜儀上，也可進(jìn)行氨基酸和肽的分離工作。

⑦近年來(lái)，用高效液相色譜法分析脂肪酸的工作取得迅速的進(jìn)展。

⑧生物堿是從植物中提取得到的含氮的一類堿性化合物，其種類繁多，如嗎啡、可待因、海洛因、蒂巴因等，可用液－液分配色譜法進(jìn)行分離。