實驗項目十九　質(zhì)粒的酶切與鑒定

學(xué)習(xí)目標

【知識目標】

（1）能用自己的語言描述質(zhì)粒的酶切與鑒定的原理。

（2）能夠迅速而準確地陳述質(zhì)粒的酶切與鑒定的實驗操作要點。

（3）能夠準確鑒別質(zhì)粒的酶切與鑒定的結(jié)果，并能說明其意義。

【能力目標】

（1）能夠正確完成各項操作內(nèi)容，做到步驟正確、動作連貫協(xié)調(diào)、內(nèi)容全面無遺漏。

（2）能夠正確分析質(zhì)粒的酶切與鑒定的結(jié)果。

案例引導(dǎo)

能通過攜帶抗原基因且在體內(nèi)表達抗原蛋白，并引起免疫應(yīng)答的重組DNA稱為核酸疫苗。核酸疫苗在設(shè)計、工藝流程、安全性、穩(wěn)定性、免疫效果等方面有著傳統(tǒng)疫苗難以企及的優(yōu)勢。通過限制性內(nèi)切酶等基因工程工具獲取攜帶抗原基因的DNA片段，通過一定的載體工具將獲取的抗原基因帶入宿主細胞進行表達，從而獲得免疫效果。請結(jié)合所學(xué)知識，思考這種可以攜帶基因進入細胞的工具是什么。

（提示：質(zhì)粒）

【實驗原理】

DNA限制性內(nèi)切酶消化是基因分析中的關(guān)鍵步驟，內(nèi)切酶是最關(guān)鍵的工具酶。核酸限制性內(nèi)切酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定堿基順序的核酸分解酶。可將其分為3型，其中Ⅱ型因具有特異的切割點且酶蛋白不具有甲基化作用，因此最為常用。

由于DNA分子的核苷酸順序是一定的，某種限制酶用于DNA的切點數(shù)也是一定的，故所得的DNA層段和片段大小也一定。通過電泳和溴化乙錠染色后，測出各DNA片段移動的位置和距離，從而推斷DNA的性狀。

影響酶解的因素很多，它們會干擾對DNA性狀的分析，甚至導(dǎo)致錯誤的分析。其中，最主要的影響因素是DNA的純度，因此必須就DNA的純度、濃度和相對分子質(zhì)量加以測定，以便進行下一步的酶切、連接和轉(zhuǎn)化實驗。測定方法通常采用以下兩種。

1.紫外分光光度法

根據(jù)計算在260nm波長下，每毫升1μg DNA鈉鹽溶液的OD值為0.020，即在OD₂₆₀＝1時，雙鏈DNA含量為50μg/mL，單鏈DNA與RNA含量為40μg/mL。

根據(jù)經(jīng)驗數(shù)據(jù)，純核酸溶液OD_280nm/OD_260nm＝0.5，即當樣品的OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0時，認為已達到所要求的純度。

2.瓊脂糖凝膠電泳法

溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光。當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，加入的溴化乙錠（EB）就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使發(fā)射的熒光增強幾十倍。而熒光的強度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估計出待測樣品的濃度。

在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值呈反比關(guān)系。凝膠電泳可以分離不同的DNA分子。在一般情況下，超螺旋狀（SC）分子遷移速度最快，其次為線性（L）分子，最慢的為開環(huán)狀（OC）分子，所以凝膠電泳也可以鑒別相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。

在提取到的質(zhì)粒DNA樣品中，如混雜有染色體DNA或RNA，則在瓊脂糖凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。將純品質(zhì)粒DNA與含有雜質(zhì)DNA、RNA的樣品做電泳圖譜比較（圖3－9）。

圖3－9　質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

至于純品質(zhì)粒DNA中為何出現(xiàn)兩條區(qū)帶，一般認為，按目前的技術(shù)水平無論怎樣提取，結(jié)果都會夾一些開裂一個鏈的開環(huán)狀質(zhì)粒，它在電泳圖譜中滯后于超螺旋狀質(zhì)粒，故形成兩條區(qū)帶。也有學(xué)者認為前區(qū)帶為單體超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒，后區(qū)帶為二聚體超螺旋結(jié)構(gòu)質(zhì)粒。無論何種解釋，它們進行單一酶切位點的限制內(nèi)切酶酶解后，都只形成一條線性DNA的區(qū)帶。

【實驗器材】

水平電泳槽，電泳架，梳子，紫外透射分析儀，Eppendorf管，Tip頭，可調(diào)移液器，恒溫水浴箱。

【藥品及試劑】

瓊脂糖，酶2U/μL，EB。

【試劑配制】

（1）5×TBE：Tris 54g、硼酸27.5g 0.5mol/L、EDTA（pH＝8.0），1mol/L EDTANa₂（pH＝8.0）加水至1000mL，同前稀釋5倍。

（2）瓊脂糖凝膠：用1×TBE配制0.8%的凝膠。

（3）1×TE緩沖液（pH＝8.0）：10mmol/L Tris－HCl（pH＝8.0），1mmol/L EDTANa₂（pH＝8.0）。

操作流程

【操作步驟】

1.質(zhì)粒的限制內(nèi)切酶消化

取3支Eppendorf管分別裝入樣品，按表3－29的操作流程進行。

表3－29　質(zhì)粒的限制內(nèi)切酶消化操作流程（單位：μL）

要點：（1）加樣器的使用。

（2）鹽與酶相匹配。

（3）做好標記，并做實驗記錄。

（4）在低溫下加樣，尤其添加質(zhì)粒和酶要在冰盒中進行，且要最后加酶。樣品混勻后離心，務(wù)必使所有藥品充分反應(yīng)，一同放入37℃恒溫水浴箱中，水浴1h。

2.離心

每管中加8μL溴酚藍，振蕩混勻，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心1min即可。

3.電泳前的準備

明確電泳槽的安裝方法及電泳儀的連接。將用來鋪瓊脂糖凝膠的盒子洗凈并擦干（包括梳子及擋板）。插上兩側(cè)擋板，用80℃以下的瓊脂糖（0.8%）溶液封住擋板底部內(nèi)側(cè)，待其凝固后，用三角燒瓶盛瓊脂糖熱溶液并迅速將其倒入平板中央，瓊脂糖高度為2.5cm左右，并插上梳子（梳子底部與玻璃板距離為1mm），凝固待用。

4.加樣

將已凝固的凝膠板放入電泳槽中，拔去梳子及擋板，添加1×TBE緩沖液，使液面平齊或略高出凝膠板。選擇相連六孔，依次加入AABBCC，每孔加樣品20μL。

要點：加樣時，端坐，兩肘放在桌面，以便于平穩(wěn)操作，吸取樣后，將Tip頭略插入孔中，不要過深，依次緩慢加樣，輕輕將Tip頭提出液面后再松手，以免回吸。

5.電泳

連通好電源，起始電壓為40mV時工作10min，然后20mV時工作12～16.5h，切勿使溴酚藍跑出凝膠板，以保證樣品仍在凝膠板上。在學(xué)生實驗過程中，由于時間關(guān)系，可加大電壓，縮短時間，實驗結(jié)果不會有太大偏差。

6.染色

電泳結(jié)束后，將凝膠板連同玻璃板一同放入盛有溴化乙錠染色液的托盤中，振蕩染色1h。

要點：溴化乙錠是強致癌物，操作時，切記戴一次性手套。

【實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

1.觀察結(jié)果

凝膠板從EB染色液中拿出后用清水沖凈，放在紫外燈觀察板上，取下玻璃板，蓋上蓋，開燈，從蓋上觀察鏡中觀察。

注意：紫外光對眼睛晶狀體有強烈刺激作用，切勿直視紫外光時間過長。

2.記錄并討論

做好實驗記錄，并進行討論。

【注意事項】

（1）EB為強誘變劑，操作時應(yīng)注意安全。

（2）實驗中含有EB的凝膠等實驗物，不要隨意倒入水池等內(nèi)，要放入規(guī)定的回收地點。

【實驗意義】

酶切技術(shù)是基因工程中一項重要的技術(shù)，對于基因重組等有重要的意義。同時，質(zhì)粒是基因工程的一個重要載體，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中起著重要的作用。

能力檢測

一、單項選擇題

1.質(zhì)粒是（　?。?/p>

A.環(huán)狀雙鏈DNA　　B.線性雙鏈DNA

C.環(huán)狀單鏈DNA　　D.線性單鏈DNA

E.環(huán)狀單鏈RNA

2.限制性核酸內(nèi)切酶可對（　?。?。

A.雙鏈DNA的特異部位進行切割　　B.單鏈DNA的特異部位進行切割

C.多肽鏈的特異部位進行切割　　　D.mRNA的特異部位進行切割

E.多肽鏈的非特異部位進行切割