三、根瘤菌和豆科植物的共生固氮

根瘤菌(Rhizobia)和豆科植物的共生固氮作用是微生物和植物之間最重要的互惠共生關(guān)系。豆科植物被特定的根瘤菌感染后，植物和根瘤菌的生理都發(fā)生變化，形成根瘤(root nodules)。根瘤是根瘤菌和植物根彼此單獨(dú)存在時(shí)所沒(méi)有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也具有彼此單獨(dú)存在時(shí)所沒(méi)有的固氮功能。共生固氮對(duì)保持土壤肥力，提高農(nóng)作物產(chǎn)量有重要作用。

與自由生活的固氮菌相比，共生固氮菌的固氮能力大大增強(qiáng)。例如，自由生活的固氮菌的聯(lián)合固氮作用每年每公頃可固氮25kg，而糧食類豆科植物(如豌豆、蠶豆和大豆等)形成的根瘤能固定植物所需總氮量的50%，固氮速率大大提高，每年每公頃能固氮100kg;草料豆科植物(如紫花苜蓿和三葉草)可固定其所需總氮源的大部分氮，每年每公頃能固氮200kg到300kg。因此，豆科植物和根瘤菌形成的根瘤共生體對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義，能顯著增加土壤中化合氮的含量，使豆科植物在貧瘠的土壤中生長(zhǎng)良好。豆科植物很多，包括非常重要的農(nóng)作物如豌豆、蠶豆、大豆、紫花苜蓿和一些結(jié)莢植物。能在豆科植物上結(jié)瘤的固氮細(xì)菌都屬于能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌，包括根瘤菌(Rhizobium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、中華根瘤菌(Sinorhizobium)和固氮根瘤菌(Azorhizobium)共4個(gè)屬16個(gè)種。

1.根瘤的發(fā)生和發(fā)育

根瘤的形成是植物和根瘤菌由遺傳因素決定的一系列復(fù)雜過(guò)程共同作用的結(jié)果。根瘤菌與豆科植物之間的共生是專一性的。一種根瘤菌菌株通常只能感染某一種特定的豆科植物。一根瘤菌群只能感染相應(yīng)交互接種群(cross-inoculation group)中的豆科植物。

并不是所有根瘤菌感染植物所形成的根瘤都具有固氮能力。如果根瘤菌是無(wú)效的，它所形成的根瘤就是不具有固氮能力的無(wú)效根瘤;無(wú)效根瘤個(gè)體小，數(shù)量多，表面光滑，切斷面呈白綠色。如果根瘤菌是有效的，它所形成的根瘤就是具固氮能力的有效根瘤;有效根瘤個(gè)體較大，表面光滑或有皺紋，剖面呈粉紅色或紅色。

根瘤菌感染豆科植物形成根瘤的過(guò)程主要包括以下幾個(gè)階段:

1)根瘤菌和相應(yīng)豆科植物之間的相互識(shí)別以及根瘤菌在植物根毛上的吸附。結(jié)瘤早期豆科植物根系可分泌多種有機(jī)物，如類黃酮化合物、少量酚類化合物和甜菜堿等，這些化合物對(duì)根瘤菌具有趨化作用，使得根瘤菌被吸附到植物根毛表面，在植物根部大量繁殖聚集。所有根瘤菌和慢性根瘤菌都能在菌表產(chǎn)生鈣結(jié)合蛋白(rhicadhesin)，并利用這種鈣結(jié)合蛋白在根毛上吸附。其他一些物質(zhì)如被稱為植物凝集素(lectins)的植物糖蛋白，在植物與根瘤菌吸附的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。

2)根瘤菌侵入根毛形成侵染線(infection thread)。在根瘤菌分泌的結(jié)瘤因子(nod factors)作用下，根毛細(xì)胞壁變軟，根毛發(fā)生卷曲，根瘤菌從變軟的細(xì)胞壁進(jìn)入根毛。在根瘤菌進(jìn)入根毛細(xì)胞的部位，根毛細(xì)胞壁內(nèi)陷，并開始分泌一種含纖維質(zhì)的物質(zhì)，將根瘤菌包圍起來(lái)，形成一條管狀結(jié)構(gòu)的侵染線(infection threads)。

3)根瘤菌通過(guò)侵染線向主根推進(jìn)。根瘤菌在侵染線內(nèi)不斷繁殖，并沿侵染線不斷向根毛基部和表皮細(xì)胞延伸。

4)根瘤菌在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃蔚木?xì)胞——類菌體(bacteroids)，發(fā)展為固氮狀態(tài)。當(dāng)侵染線到達(dá)根的皮層細(xì)胞后，它的前端膨大，不再形成侵染線壁，根瘤菌被釋放到植物細(xì)胞中。從侵染線釋放出的根瘤菌在細(xì)胞中迅速地大量繁殖，并轉(zhuǎn)變成逐漸膨大、畸形和分叉的類菌體。單個(gè)或多個(gè)類菌體被部分植物細(xì)胞膜包裹，形成共生體(symbiosome)。只有當(dāng)共生體形成以后固氮作用才開始。

5)根瘤菌和植物細(xì)胞繼續(xù)分裂，形成成熟的根瘤。植物開始衰老時(shí)，根瘤逐漸衰退，類菌體將最終從根瘤中被釋放入土壤。被釋放出的類菌體不具有分裂增生的能力，但總會(huì)存在一小部分休眠的桿狀細(xì)胞。這些桿狀細(xì)胞能利用衰退根瘤的產(chǎn)物為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行增殖擴(kuò)散，并能感染其他植物根或在土壤中游離生活。

2.根瘤形成的遺傳基礎(chǔ)

根瘤的形成取決于結(jié)瘤基因的存在。根瘤菌感染豆科植物形成根瘤的過(guò)程中，指令特定結(jié)瘤步驟的基因被稱為結(jié)瘤基因。結(jié)瘤基因大多與結(jié)瘤因子(nod factors)的合成和外運(yùn)有關(guān)，這些基因可分為調(diào)節(jié)基因(Nod D)、共同結(jié)瘤基因(common nodulation genes，Nod A，B，C)和寄主特異性結(jié)瘤基因(host-specific nodulation genes)3類。對(duì)于根瘤菌(Rhizobiumspp.)來(lái)說(shuō)，結(jié)瘤基因大多數(shù)位于質(zhì)粒(plasmids)上，而慢性根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)、固氮根瘤菌屬(Azorhizobiumspp.)和百脈根根瘤菌(Rhizobiumloti)的結(jié)瘤基因均在染色體上。所有的根瘤菌都存在共同結(jié)瘤基因(common nodulation genes，Nod A，B，C)，基因Nod D也普遍存在于所有根瘤菌中，且是唯一一種能在缺乏相應(yīng)寄主時(shí)表達(dá)的結(jié)瘤基因。

根瘤菌的共同結(jié)瘤基因和寄主特異性結(jié)瘤基因的表達(dá)控制著根瘤的形成，這些結(jié)瘤基因大部分從植物和根瘤菌相遇就開始表達(dá)直到根瘤菌被釋放入寄主細(xì)胞。

目前認(rèn)為基因Nod D的產(chǎn)物能與相應(yīng)的寄主植物分泌物特別是類黃酮(flavenoids)相互作用，誘導(dǎo)共同結(jié)瘤基因Nod ABC的表達(dá)，引起根瘤形成。類黃酮是一類復(fù)雜的酚類化合物，對(duì)細(xì)菌內(nèi)膜有很高的親和性，能插入內(nèi)膜磷脂雙分子層。

寄主特異性結(jié)瘤基因(host-specific nodulation genes)決定結(jié)瘤因子的寄主專一性。寄主特異性結(jié)瘤基因的差異取決于根瘤菌的種類，目前已在不同的根瘤菌中鑒定出50多種寄主特異性結(jié)瘤菌基因。結(jié)瘤因子(nod factors)，是主要的寄主專一性決定因子之一。目前已知結(jié)構(gòu)特征的根瘤菌的結(jié)瘤因子至少有13種。結(jié)瘤因子是三到六聚的乙酰葡萄糖胺組成的寡糖，并受到多種修飾(如脂肪酰基化及磺基化)，很可能是根瘤原基形成和早期結(jié)瘤基因表達(dá)所需的唯一信號(hào)分子，是根瘤菌與寄主特異識(shí)別的主要信號(hào)。結(jié)瘤因子由Nod ABC和寄主特異性結(jié)瘤基因共同編碼合成，Nod ABC編碼合成結(jié)瘤因子的寡糖骨架，因此所有的根瘤菌的結(jié)瘤因子都具有相同的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu);寄主特異性結(jié)瘤基因負(fù)責(zé)添加修飾基團(tuán)，為結(jié)瘤因子提供寄主專一性。大部分根瘤菌菌株不能產(chǎn)生單一的結(jié)瘤因子，但有相當(dāng)多的根瘤菌菌群能產(chǎn)生具有不同結(jié)合特征的結(jié)瘤因子，這些結(jié)瘤因子能產(chǎn)生協(xié)同作用誘導(dǎo)結(jié)瘤反應(yīng)。結(jié)瘤因子是決定根瘤菌特異性寄主的主要因素。

3.根瘤的形態(tài)和功能

當(dāng)根瘤菌從侵染線釋放出時(shí)，細(xì)胞開始分裂，在感染后的1～2星期，可見的根瘤開始出現(xiàn)。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，豆科植物根瘤可以分為有限型根瘤(determinate nodules)和無(wú)限型根瘤(indeterminate nodules)。有限型根瘤無(wú)分生組織，生長(zhǎng)發(fā)育一段時(shí)間后，各部分同時(shí)分化成熟，根瘤體積不再增大。這類根瘤外形一般為球形，如大豆根瘤。無(wú)限型根瘤具有頂端分生組織，在根瘤成熟后仍可繼續(xù)生長(zhǎng)，使根瘤體積增大，甚至可以分叉。這類根瘤的外形多為圓柱形、囊狀、雞冠狀，如豌豆、三葉草和苜蓿等植物的根瘤。無(wú)論是哪種根瘤，固氮作用都開始在根瘤形成大約15天后。

固氮是固氮菌和植物共同作用的結(jié)果。一般條件下，根瘤菌盡管能生長(zhǎng)繁殖，但不能固氮，只有進(jìn)入宿主植物根，宿主提供固氮所需的條件，才能固氮。在純培養(yǎng)時(shí)，根瘤菌只能在嚴(yán)格控制的微好氧條件下才具有固氮能力。這是因?yàn)椋鼍枰鯙楣痰饔卯a(chǎn)能，而固氮酶對(duì)氧敏感，在氧壓較高時(shí)又容易失活。在根瘤中，植物不但向真菌不斷提供低濃度、高流量的自由O₂，且O₂濃度的精確水平由能與O₂結(jié)合的豆血紅蛋白(leghemoglobin，Lb)控制，Lb在氧化態(tài)(Fe³⁺)和還原態(tài)(Fe²⁺)之間循環(huán)起著調(diào)節(jié)氧的緩沖劑的作用，解決了類菌體固氮需氧與不需氧的矛盾，使呼吸作用和固氮作用能協(xié)調(diào)地進(jìn)行。然而，植物不能獨(dú)立地合成Lb，植物合成Lb，需要與根瘤菌共同作用的誘導(dǎo)。

根瘤固氮的產(chǎn)物并不為根瘤菌自身同化所利用，絕大部分通過(guò)類菌體周膜分泌到植物細(xì)胞漿中，在那里被同化為酰胺態(tài)或酰脲態(tài)簡(jiǎn)單化合物，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到植物其他部分中去利用。無(wú)限型根瘤的固氮產(chǎn)物為NH₃，并最終以天冬酰胺的形式運(yùn)輸?shù)街参锏哪壑ΑＳ邢扌透龅墓痰a(chǎn)物NH₃，最終以嘌呤的形式運(yùn)輸?shù)街参锬壑Α?/p>

根瘤共生固氮在遺傳上也是根瘤菌和宿主植物共同作用的結(jié)果。一般根瘤菌具有固氮作用的全部遺傳因子，而感染性(結(jié)瘤作用)是由根瘤菌和豆科植物共同決定的。植物基因控制能否結(jié)瘤或形成無(wú)效根瘤，根瘤菌帶有決定感染性和專一性的基因。豆血紅蛋白中血紅素部分由根瘤菌的基因決定，而蛋白部分由植物基因決定。

根瘤共生固氮量取決于植物品種和根瘤菌菌種。同時(shí)根瘤共生固氮也受包括土壤濕度、土壤中氧氣含量、溫度、土壤酸度、化合態(tài)氮素、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境因子的影響。