經(jīng)過PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺電泳和硝酸銀染色，單態(tài)的標(biāo)記有17個；多態(tài)性的標(biāo)記有53個，其中適合進(jìn)行微衛(wèi)星多態(tài)性分析的有21對，其余33對引物多態(tài)性太低而未被采用。圖19為Pot54位點(diǎn)在三疣梭子蟹30個個體中擴(kuò)增得到的電泳圖譜的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

圖19　Pot54位點(diǎn)在三疣梭子蟹30個個體中擴(kuò)增得到的電泳圖譜的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

在微衛(wèi)星標(biāo)記的引物設(shè)計中微衛(wèi)星序列的選取是非常重要和關(guān)鍵的。微衛(wèi)星的核心序列有各種各樣的類型，關(guān)于何種類型核心序列的微衛(wèi)星篩選出微衛(wèi)星標(biāo)記的的可能性較大，一直以來眾說紛紜。張?zhí)鞎r等（2004）對各種類型核心序列進(jìn)行了部分研究。結(jié)果表明，在擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物中的微衛(wèi)星引物中，多態(tài)性的比例相對來說還是比較高的。篩選出的微衛(wèi)星標(biāo)記的核心序列是2個堿基、3個堿基或4個堿基為基本重復(fù)單位的序列，這與Pongsomboond等（2000）和Xu等（2001）斑節(jié)對蝦（P.monodon）中以三堿基和四堿基為基本重復(fù)序列的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選效果較好的結(jié)果相符。同樣，在本實驗中，21對微衛(wèi)星引物的核心序列以2個堿基、3個堿基為基本重復(fù)單位的序列，21個微衛(wèi)星位點(diǎn)的雜合度、多臺信息含量均很高，顯示出豐富的多態(tài)性，實驗結(jié)果與以上研究成果相符合。

在微衛(wèi)星核心序列的重復(fù)次數(shù)方面，Weber（1990）認(rèn)為，只有在雙堿基重復(fù)序列次數(shù)大于12次時，微衛(wèi)星標(biāo)記才有可能表現(xiàn)出較高PIC值，才可以進(jìn)行相應(yīng)的多態(tài)性分析。如位點(diǎn)Pot46和位點(diǎn)Pot47，以（GA）為基本重復(fù)單位，最多重復(fù)次數(shù)只有8次，所以等位基因數(shù)目少，分別為3個和9個，雜合度和PIC值也偏低。Xu等曾在斑節(jié)對蝦進(jìn)行微衛(wèi)星引物設(shè)計，最后的結(jié)果也表明，凡是核心序列重復(fù)次數(shù)較少的微衛(wèi)星標(biāo)記，其結(jié)果或單太或等位基因數(shù)目非常少，PIC值也偏低。因此在選用的微衛(wèi)星序列的核心序列的重復(fù)次數(shù)上應(yīng)在一個較高的水平上，避免出現(xiàn)由于微衛(wèi)星核心序列過短，造成微衛(wèi)星標(biāo)記篩選中多態(tài)性引物比較低而造成浪費(fèi)。

利用微衛(wèi)星引物對三疣梭子蟹海州灣群體30個個體進(jìn)行遺傳多樣性分析。對每一個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)目（其中純合個體的等位基因出現(xiàn)兩次計算）進(jìn)行統(tǒng)計。根據(jù)各個微衛(wèi)星位點(diǎn)各種基因型頻率計算其觀察雜合度，根據(jù)各個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率，分別計算它們的期望雜合度和多態(tài)信息含量（PIC），計算結(jié)果列于表12。

表12　三疣梭子蟹21對微衛(wèi)星引物退火溫度及其評價

續(xù)表

注：*表示嚴(yán)重偏離哈迪-溫伯格平衡的位點(diǎn)

從表中可以看出，在三疣梭子蟹30個樣本的21個微衛(wèi)星位點(diǎn)中，統(tǒng)計21個位點(diǎn)共獲得了188個等位基因，平均每個位點(diǎn)擴(kuò)增得到8.9個等位基因。不同引物獲得的等位基因數(shù)差異較大，從3～13個不等，其中Pot8、Pot37、Pot48、Pot53、Pot54、Pot66等6個位點(diǎn)分別獲得了11、12、12、11、13、11個等位基因，而Pot46只獲得了3個等位基因，等位基因的大小在131～312 bp，基本上符合引物設(shè)計時理論產(chǎn)物長度。期望雜合度的范圍從0.716到0.913，表明它們都有較高的雜合度。PIC值從0.6.9　～ 0.889，21個位點(diǎn)的PIC值高于0.5，表明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)在三疣梭子蟹中均具有較高的信息含量。位點(diǎn)Pot66的觀察雜合度與期望值有較大的出入，其他微衛(wèi)星位點(diǎn)的這兩值均基本相符。

在篩選出來的21對引物中，5對引物分別在3個個體中未擴(kuò)增出譜帶。這可能是因為在該位點(diǎn)上出現(xiàn)了無效等位基因（null allele）所引起的。無效等位基因的出現(xiàn)是因群體中個別個體引物結(jié)合位點(diǎn)的堿基出現(xiàn)缺失、突變或插入，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時引物與模版DNA無法結(jié)合，從而不能擴(kuò)增目的片段。Ardren（1999）和李莉（2003）分別在虹鱒（S. gairdneri）和長牡蠣（O. gigas）的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)過無效等位基因。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個座位的觀測雜合度和期望雜合度存在較大差異，經(jīng)哈迪-溫伯格平衡檢驗，是由于雜合子的嚴(yán)重缺乏（P , 0.005表中*所示）造成的。相關(guān)分析指出雜合子缺失大多由于無效等位基因引起。由于微衛(wèi)星序列點(diǎn)突變頻率（1022～1025）和復(fù)制滑脫頻率（1023～1024）很高，無效等位基因存在包括哺乳類、魚類、甲殼類在內(nèi)的許多生物中。所以在種群研究中，如果無效等位基因存在而不被考慮，就會導(dǎo)致群體中純合子過?；螂s合子缺失的現(xiàn)象，從而出現(xiàn)觀測雜合度與期望雜合度偏離的現(xiàn)象。

遺傳標(biāo)記的多態(tài)性程度及其應(yīng)用價值一般可用雜合度（H）、多態(tài)信息含量（PIC）、個體識別力（DP）和非父排除率（PPE）來衡量。根據(jù)Bostein等（1980）提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC . 0.5時，該基因座為高度多態(tài)基因座；當(dāng)0.25 , PIC , 0.5時，為中度多態(tài)基因座；當(dāng)PIC , 0.25時，則為低度多態(tài)基因座。本實驗結(jié)果顯示21個微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)信息含量PIC . 0.5，為高度多態(tài)性，在三疣梭子蟹群體遺傳學(xué)研究中能提供確切的遺傳信息。

本實驗21個微衛(wèi)星標(biāo)記在30個樣本中觀測到3 ～?13個等位基因，而與Pongsomboond等（2000）和Xu等（2001）在斑節(jié)對蝦中篩選得到多態(tài)性最高的微衛(wèi)星標(biāo)記，其等位基因最多分別達(dá)到29和25個，大大高出本研究中所得到的最大等位基因數(shù)，可能是聚丙烯酰胺電泳以及在微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因統(tǒng)計中出現(xiàn)的偏差對分析微衛(wèi)星電泳結(jié)果可能有局限性。由于微衛(wèi)星的較強(qiáng)多態(tài)性，常常使得兩條電泳帶（等位基因）之間僅僅只有幾個堿基的差別，反映在電泳膠上可能非常近，在區(qū)分兩條帶時很可能造成誤判，將兩條非常近的帶認(rèn)為是1條。因此，建議使用測序儀的毛細(xì)管電泳結(jié)合熒光標(biāo)記再利用其中的Genescan功能進(jìn)行分析。

SSR標(biāo)記在不同的群體中存在差異，有的等位基因為個別群體所特有，可作為群體遺傳差異的特異帶（王杰等，2006）。Barker（1994）研究指出，在利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳距離分析時，要求SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)不少于4個，少于4個或沒有擴(kuò)增條帶的SSR標(biāo)記應(yīng)該排除?；谶@一理論，本實驗篩選出的21對引物中有20對引物的等位基因數(shù)大于4，可利用這些位點(diǎn)來進(jìn)行不同群體三疣梭子蟹的群體間遺傳距離分析。羅云等（2010）利用SSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合“擬測交”策略，以三疣梭子蟹萊州灣、舟山野生群體雜交產(chǎn)生的F2代家系為作圖群體，初步構(gòu)建了三疣梭子蟹雌、雄性遺傳連鎖圖譜，圖譜中遺傳標(biāo)記分布比較均勻，充分說明了SSR標(biāo)記應(yīng)用的合理性。

（作者：韓智科，劉萍，李健，高保全，陳萍）