PCR擴增完成之后，必須通過嚴格的檢測分析，才能確定是否真正得到了準確可靠的預期特定擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的檢測，可依據(jù)研究對象和目的的不同而采用不同的分析方法。判斷PCR的有效性和正確性可通過對PCR產(chǎn)物進行電泳分離，觀察擴增條帶有無、擴增片段的大小而實現(xiàn)。如果要了解擴增產(chǎn)物的序列是否正確，則必須對產(chǎn)物作進一步分析。

(一)凝膠電泳

凝膠電泳是檢測PCR產(chǎn)物常用和最簡便的方法，能迅速判斷有無預期大小的擴增產(chǎn)物。DNA在電泳緩沖液(偏堿性)里帶負電荷，在電場作用下，從凝膠的負極向正極泳動。DNA分子凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者主要用于DNA片段>100bp者，后者主要用來檢測小片段DNA。

1.瓊脂糖凝膠電泳　這是實驗室最常用的檢測PCR產(chǎn)物的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于速度不同而被分離，經(jīng)溴化乙錠(EB)染色，在紫外線照射下DNA分子發(fā)出橙紅色熒光而判定其分子的大小。不同濃度的瓊脂糖凝膠分辨線性DNA的有效范圍不同(表4-1)。

2.聚丙烯酰胺凝膠電泳　聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N′-甲叉雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳與瓊脂糖凝膠電泳比較具有如下優(yōu)點：①分辨率很強，長度僅相差1bp的DNA分子即可分開；②能裝載的DNA量大，達每孔10μg DNA；③回收的DNA純度高；④其銀染法的靈敏度較瓊脂糖中EB染色法高2～5倍；⑤避免了EB迅速褪色的弱點，銀染的凝膠干燥后可長期保存。其濃度與線性DNA有效范圍關系如表4-2所示。

表4-1　瓊脂糖濃度與分離DNA分子的有效范圍

表4-2　丙烯酰胺濃度與分離DNA分子的有效范圍

(二)限制性片段長度多態(tài)性分析

限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)的原理是利用限制性核酸內切酶識別并剪切特定DNA序列的能力，檢測基因片段上該酶識別位點處是否存在核苷酸突變，識別位點處核苷酸的改變將導致原酶切位點的消失或產(chǎn)生新的酶切位點，使得酶切后片段大小發(fā)生變化，通過瓊脂糖凝膠電泳即可判斷有無突變發(fā)生。PCR和RFLP的結合加快和簡化了分析的過程，得到廣泛的應用。但是，PCR-RFLP也有一定的局限性，并不是基因片段中任意核苷酸的變化都能引起相應限制性核酸內切酶識別位點的改變，而且相隔很近并同時發(fā)生的點突變都導致此種方法無從入手。此法主要用于傳染病病原體基因分型和人類基因變異性的研究。

(三)分子雜交法

雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。檢測PCR擴增產(chǎn)物常見的雜交方法有點雜交、反向點雜交、微孔板夾心雜交、Southern印跡雜交以及RNA探針雜交酶免分析等。分子雜交技術詳見第5章。

(四)PCR-寡核苷酸連接試驗法

寡核苷酸連接試驗(oligonucleotide link assay，OLA)是為檢出單一核苷酸的突變而設計的，它可以單獨或結合PCR快速確定緊密相關的DNA序列。OLA是通過設計兩種能與靶序列DNA精確配對雜交的寡核苷酸完成的。寡核苷酸雜交后，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰堿基共價連接，而錯配的相鄰堿基可通過調節(jié)連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產(chǎn)物可通過凝膠電泳觀察其大小，或通過5′端修飾技術使一個寡核苷酸5′端帶有一個堿基，連接后通過固相化的親和堿基使其固定，漂洗后檢測另一寡核苷酸3′端攜帶的適當標記分子。這一過程如重復進行多個循環(huán)，則連接產(chǎn)物會呈線性增加，故稱此循環(huán)進行的OLA為連接檢測反應。

(五)單鏈構象多態(tài)性

單鏈構象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism，SSCP)的基本原理是，將PCR擴增得到的雙鏈DNA(dsDNA)經(jīng)變性處理成單鏈DNA(ssDNA)，加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。單鏈DNA構象的變化將引起其在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel eleceophoresis，PAGE)中遷移率的改變，而單鏈DNA的構象與一級序列密切相關。因此，DNA一級序列的輕微改變都能在PAGE電泳中表現(xiàn)出來。通常，將待檢測DNA片段通過PCR擴增及產(chǎn)物變性后進行SSCP分析，引入適當?shù)膶φ毡容^電泳結果就可以確定發(fā)生突變的樣本。

PCR-SSCP的主要優(yōu)點相對簡單，可用于分析各種類型的基因突變。如缺失、插入和點突變。該技術的不足之處是可能漏檢一些突變，因為不同的DNA一級序列組成、PAGE電泳條件及PCR產(chǎn)物大小對檢測靈敏度都有一定的影響。DNA片段中A、G含量豐富的鏈比C、T含量豐富的鏈對堿基的改變更敏感。改變凝膠的濃度有時也可以提高檢測單個堿基改變的靈敏度。隨著PCR產(chǎn)物片段長度的增加，突變對它們在電泳中遷移率改變的影響逐漸減小。因此，根據(jù)經(jīng)驗，SSCP方法僅適合于300bp以內的PCR產(chǎn)物，對于大片段DNA突變的檢出率較低。

(六)異源雙鏈分析

異源雙鏈分析(hereroduplex analysis，HA)與SSCP方法相似，該法利用PAGE作為擴增后的分析手段。所謂異源雙鏈是指PCR擴增中由突變型和野生型DNA形成的雜合雙鏈DNA分子。它與同源雙鏈在PAGE電泳中呈現(xiàn)不同的電泳速率，從而將野生型和突變型雙鏈DNA分開，從而達到檢測基因突變的目的。與SSCP一樣，隨著PCR產(chǎn)物片段長度的增加，突變對它們在電泳中遷移率改變的影響逐漸減小，HA法僅對300bp以內DNA的突變檢測效果較好。

(七)測序法

測序法是將PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序或直接對PCR產(chǎn)物進行測序，是所有檢測方法中最靈敏、最全面的。但是，測序法所需的儀器和高昂的費用使得它并沒有在臨床診斷中得到普及，多用于研究工作。DNA測序技術詳見第6章。

(八)PCR-ELISA法

因為引物5′端修飾后不影響PCR擴增，因此可以通過修飾一條引物的5′端使其攜帶便于產(chǎn)物固定的功能基團(如標記生物素，可使產(chǎn)物與固定于包被板上的親和素結合)，另一引物5′端標記另一顯色基團(如標記FITC，用HRP標記的抗FITC結合顯色)，以使產(chǎn)物便于檢測。該法省去了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA計數(shù)儀檢測。