在PCR及其相關(guān)技術(shù)發(fā)展的同時，新的擴(kuò)增技術(shù)也不斷誕生。這些技術(shù)各有利弊，可與PCR互為補(bǔ)充或結(jié)合應(yīng)用，共同構(gòu)成了核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的大家族。

1.連接酶鏈反應(yīng)　連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction，LCR)是在連接酶擴(kuò)增反應(yīng)或連接酶檢測反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引入耐熱連接酶而建立的類似PCR技術(shù)的新方法。LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，其產(chǎn)物的檢測也較方便靈敏。目前該方法主要用于點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等。LCR的基本原理為利用DNA連接酶的特性，即可以特異地將與靶序列完全互補(bǔ)的相鄰兩條DNA單鏈連接在一起，然后經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶序列大量擴(kuò)增。在模板DNA、DNA連接酶、引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補(bǔ)，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增。若連接處的靶序列有點突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物(圖4-19)。其中，LCR的引物是兩對分別互補(bǔ)的引物，并與靶序列相鄰的區(qū)域結(jié)合。LCR識別點突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性，LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識別單核苷酸錯配的特異性極高。

2.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA　隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNAs，RAPD)是以PCR為基礎(chǔ)，由一系列人工隨機(jī)合成的寡核苷酸鏈(通常為10bp)為引物，以所研究的整個基因組DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。與PCR相比，其特點是用一組隨機(jī)序列的引物與模板DNA做隨機(jī)配對，反應(yīng)過程中隨機(jī)引物只有在與模板DNA互補(bǔ)后，在足夠近的間距(200～2000bp)內(nèi)，方向相對的兩個引物片段之間的模板DNA序列才能被擴(kuò)增。當(dāng)不同個體DNA序列之間存在差異或發(fā)生突變，經(jīng)擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物片段長度會有所不同，經(jīng)過電泳分離便可以發(fā)現(xiàn)這種差異，從而可了解和比較兩個生物體(不同物種之間或同一物種不同個體之間)基因組DNA的結(jié)構(gòu)等信息。

3.核酸序列依賴擴(kuò)增　核酸序列依賴擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一種等溫擴(kuò)增RNA的技術(shù)，它能直接擴(kuò)增單鏈RNA特異序列，通過合成cDNA的中間環(huán)節(jié)，在等溫條件下進(jìn)行體外序列特異性核酸擴(kuò)增，主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測和測序。與PCR相比，其特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)，整個反應(yīng)過程由3種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高，其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好。

圖4-19　連接酶鏈反應(yīng)原理

NASBA反應(yīng)有賴于AMV反轉(zhuǎn)錄酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作完成，此外還含有dNTP、NTP、兩種特殊的引物和緩沖液。引物1的3′末端與靶序列互補(bǔ)，5′端含有T7RNA多聚酶的啟動子，這一引物用于合成cDNA。引物2與cDNA的5′末端互補(bǔ)。其基本原理：首先引物1與RNA模板復(fù)性，AMV反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA；引物2隨即與此cDNA的5′末端結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈。這樣形成的雙鏈DNA含有T7RNA多聚酶的啟動子。T7RNA多聚酶即以此雙鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄出與模板RNA序列相同的RNA鏈，每條新的RNA又可作為反轉(zhuǎn)錄酶的模板合成cDNA。如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA(圖4-20)。

圖4-20　核酸序列依賴擴(kuò)增原理