隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，外科手術(shù)、聯(lián)合化療、放射治療、造血干細(xì)胞移植及生物免疫治療等技術(shù)的綜合應(yīng)用已經(jīng)使包括兒童急性白血病在內(nèi)的兒童惡性腫瘤的預(yù)后得到了極大改善，已有相當(dāng)一部分病例得到臨床治愈。據(jù)統(tǒng)計(jì)在兒童急性白血病中，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）的5年無(wú)病生存率（EFS）已達(dá)70%～90%，急性髓細(xì)胞性白血病（AML）的5年EFS也達(dá)40%～60%。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的3年EFS也達(dá)70%左右。而另一方面，在如此眾多的治療手段中選擇最合適的療法和治療強(qiáng)度可能更為重要。按照腫瘤病理類(lèi)型、細(xì)胞學(xué)類(lèi)型及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的分型，如白血病的形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)（MICM）分型，已經(jīng)使得兒童腫瘤的分型日趨精細(xì)。根據(jù)這些分型可以對(duì)各種腫瘤進(jìn)行危險(xiǎn)度分層，并指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇合適的方案進(jìn)行治療。

誠(chéng)然，目前的各種分型方法給兒童腫瘤的療效提高作出了重要貢獻(xiàn)。但是，所有上述的分型參數(shù)均只強(qiáng)調(diào)腫瘤發(fā)生時(shí)腫瘤本身的生物學(xué)特征。而實(shí)際上惡性腫瘤的治療不僅僅與腫瘤細(xì)胞本身的生物學(xué)特征有關(guān)。僅就化療而言，除了上述因素外，療效還跟腫瘤細(xì)胞所處的周?chē)h(huán)境有關(guān)，如骨髓基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤血液供應(yīng)及患者機(jī)體對(duì)藥物的代謝、分布、排泄個(gè)體差異有關(guān)。目前，我們還不能僅僅通過(guò)診斷式的一次檢查確定所有可能因素對(duì)療效的影響。但是既然這些因素可以影響療效，那么我們可以在治療中隨時(shí)對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)，觀察治療中腫瘤細(xì)胞的清除速率或一個(gè)療程后腫瘤細(xì)胞的殘留率，這相當(dāng)于一個(gè)體內(nèi)的藥敏試驗(yàn)。既往，人們通過(guò)細(xì)胞學(xué)或影像學(xué)的檢查來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)并取得了較好的結(jié)果。但是，由于這些檢查的先天不足使得其檢測(cè)靈敏度較低。就白血病而言，傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)檢查檢出極限是10-2。所以，在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢查不能發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞時(shí)，部分患者可能骨髓細(xì)胞中白血病細(xì)胞的比例不到10-5；但有些患者卻可能高達(dá)10-2時(shí)體內(nèi)的白血病細(xì)胞總量為105～108。體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞越多，復(fù)發(fā)的可能性越大。那么，同樣是完全緩解的患者，由于他們體內(nèi)白血病的殘留量不同，他們復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性也不相同。為了盡可能清除殘留的白血病細(xì)胞，當(dāng)前最容易想到或做到的是增加化療強(qiáng)度。但是，這種盲目地提高化療強(qiáng)度，雖然可以降低白血病的復(fù)發(fā)率，但同時(shí)也增加了治療相關(guān)的不良反應(yīng)，治療相關(guān)死亡率的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。而實(shí)際上很大一部分患者并不需要如此強(qiáng)烈的化療。如何來(lái)甄別哪一部分患者因?yàn)闅埩糨^多的腫瘤細(xì)胞，需要更加強(qiáng)烈的化療，甚至造血干細(xì)胞移植，這是避免過(guò)度治療的關(guān)鍵。我們唯一能做到的就是增加白血病或腫瘤克隆的檢出敏感性和特異性。我們把經(jīng)過(guò)治療后機(jī)體內(nèi)殘留的不被常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的少量腫瘤細(xì)胞稱為微小殘留?。∕RD）。通過(guò)MRD的監(jiān)測(cè)我們可以更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)治療對(duì)腫瘤的殺傷作用，動(dòng)態(tài)地區(qū)分腫瘤患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。

另一方面，通過(guò)MRD監(jiān)測(cè)可以早期預(yù)報(bào)腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤患者在經(jīng)過(guò)治療后可獲得緩解，但停止化療或腫瘤細(xì)胞發(fā)生原發(fā)或繼發(fā)耐藥后，體內(nèi)殘留白血病細(xì)胞克隆將不斷增殖，再次出現(xiàn)白血病臨床表現(xiàn)，即復(fù)發(fā)。人們發(fā)現(xiàn)在患兒復(fù)發(fā)前即使骨髓原始細(xì)胞＜5%，MRD監(jiān)測(cè)也可發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖，表現(xiàn)為持續(xù)陽(yáng)性或負(fù)荷逐漸增多。定期檢測(cè)MRD有助于早期發(fā)現(xiàn)可疑病例并給予早期干預(yù)治療，從而延長(zhǎng)患者CR期和長(zhǎng)期存活率。

再者，通過(guò)MRD監(jiān)測(cè)可以區(qū)別白血病細(xì)胞和正常幼稚細(xì)胞。在白血病化療后的骨髓恢復(fù)期可以出現(xiàn)較多的幼稚細(xì)胞，有時(shí)可以超過(guò)5%（圖4-7）。若以形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)即可判為復(fù)發(fā)。但是如果進(jìn)行短期隨訪，我們可以發(fā)現(xiàn)這些患者的幼稚細(xì)胞可以重新恢復(fù)到正常。如果通過(guò)MRD監(jiān)測(cè)可以很容易地鑒別正常幼稚細(xì)胞和白血病細(xì)胞。

最后，幾乎所有的腫瘤復(fù)發(fā)均起源于MRD，這是10%～30%的白血病患兒因疾病復(fù)發(fā)而導(dǎo)致治療失敗的根源，也是其他腫瘤復(fù)發(fā)的禍根。針對(duì)MRD的治療有助于惡性腫瘤最終預(yù)后的改善；而發(fā)現(xiàn)MRD是最終治療MRD的首要條件。

圖4-7　白血病細(xì)胞（左）和骨髓抑制恢復(fù)期骨髓象（右）比較（見(jiàn)書(shū)末彩圖）

一、急性淋巴細(xì)胞白血病的微小殘留病的監(jiān)測(cè)

MRD的監(jiān)測(cè)實(shí)際上是在大量正常細(xì)胞中檢出少量的腫瘤細(xì)胞，歸根結(jié)底是發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)志。在ALL中可以用于MRD監(jiān)測(cè)的特異性標(biāo)志為特異性融合基因，如t（17；19）、t（1；19）、t（11；14）、t（4；11）、t（9；22）等。它們引起白血病的分子機(jī)制也是白血病細(xì)胞特異的分子標(biāo)志，對(duì)其檢出可以代表白血病細(xì)胞的殘留。由于基因斷裂點(diǎn)的融合的隨機(jī)性及內(nèi)含子的存在，基因組DNA水平融合變化很大，只能通過(guò)原位熒光雜交方法（FISH）進(jìn)行檢測(cè)。或者通過(guò)檢測(cè)它們的轉(zhuǎn)錄本，常用的方法是反轉(zhuǎn)錄PCR。但由于其分布僅限于少數(shù)特殊的白血病類(lèi)型，且必須得到相應(yīng)融合基因的特異序列等，因此并不能作為廣泛的MRD檢測(cè)指標(biāo)。

免疫球蛋白基因和T細(xì)胞受體（TCR）的重排（圖4-8）：在淋巴細(xì)胞的胚系發(fā)育過(guò)程中免疫球蛋白基因和T細(xì)胞受體基因均須經(jīng)過(guò)基因選擇、拼接等重排過(guò)程形成成熟B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白可變區(qū)的多樣性和T細(xì)胞的TCR可變區(qū)的多樣性。每一種重排方式幾乎都是唯一的，所以在用PCR檢測(cè)時(shí)只能得到涂抹條帶或根本擴(kuò)增不出陽(yáng)性的條帶。但是，在淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中由于其單克隆性，所有白血病細(xì)胞都擁有同樣的重排方式。在用PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以在電泳時(shí)呈單一條帶；如果根據(jù)每一例患者設(shè)計(jì)不同的引物和探針可以特異地檢出白血病克隆。在ALL，IgH和（或）TCR基因重排的發(fā)生率很高，約98%的B-ALL有IgH基因重排；而T-ALL中，約有91%具有TCRγ基因重排，96%具有TCRδ基因重排，89%TCRβ基因重排。

1．基因的異常表達(dá) 在正常骨髓細(xì)胞和外周血細(xì)胞中WT1的表達(dá)極低，甚至無(wú)法被PCR技術(shù)檢測(cè)到，但在急性白血病細(xì)胞中往往有較高的表達(dá)。所以也有人試圖用它來(lái)作為MRD的標(biāo)志。但是WT1作為MRD標(biāo)志的敏感性和特異性均不是太理想，而且在ALL中有細(xì)胞免疫標(biāo)記、免疫球蛋白基因重排標(biāo)記及融合基因標(biāo)記等特異性和敏感性均很高的MRD標(biāo)記，它們的綜合應(yīng)用可以覆蓋絕大多數(shù)病例。所以WT1的表達(dá)很少被用作ALL的MRD標(biāo)記。

2．細(xì)胞免疫標(biāo)記的異常（LAIP） 人類(lèi)血細(xì)胞的分化與發(fā)育來(lái)自于造血干細(xì)胞（HSC），從HSC分化至各種成熟血細(xì)胞成分是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。HSC在多種生長(zhǎng)因子驅(qū)動(dòng)下，向各

圖4-8　淋巴細(xì)胞胚系發(fā)育過(guò)程的基因重排

個(gè)造血細(xì)胞系列分化，并會(huì)出現(xiàn)特定的分化抗原。正常情況下，這些抗原具有階段特異性和特定的表達(dá)順序或規(guī)律，如CD34僅在造血干／祖細(xì)胞上表達(dá)而不在較成熟的血細(xì)胞上表達(dá)；CD3、CD20、CD11b、CD15、GP-A、CD41等僅在較成熟的T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓細(xì)胞、紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞上表達(dá)，而不在幼稚的HSC上表達(dá)；CD45在所有白細(xì)胞上表達(dá)等。與正常造血細(xì)胞相比，白血病細(xì)胞上的這種分化抗原表達(dá)規(guī)律遭到破壞，出現(xiàn)白血病細(xì)胞相關(guān)性表型特征，主要表現(xiàn)有：①血細(xì)胞分化成熟過(guò)程中正常表達(dá)的抗原缺失或表達(dá)過(guò)度，如B細(xì)胞系急性淋巴細(xì)胞性白血病CD45的表達(dá)缺失或T-ALL時(shí)CD34、末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）的表達(dá)過(guò)度等；②淋巴系和髓系相關(guān)抗原共表達(dá)，如CD22、CD33的共表達(dá)等；③不成熟和成熟抗原的非生理性共表達(dá)，如CD34、CD56的共表達(dá)；④細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抗原同時(shí)表達(dá)，如TALL的細(xì)胞膜（m）CD7／細(xì)胞質(zhì)；⑤CD3、B-ALL的mCD19／cCD22等。表4-5為常見(jiàn)的ALL異常免疫表型組合及其發(fā)生頻率。

表4-5　ALL MRD檢測(cè)免疫表型組合

根據(jù)目前國(guó)際上急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL）治療各階段微小殘留?。∕RD）評(píng)估的研究進(jìn)展，MRD高水平對(duì)預(yù)后的影響已得到公認(rèn)，檢測(cè)的主要方法為流式細(xì)胞儀免疫表型組合特征檢測(cè)、特殊融合基因標(biāo)記PCR定量檢測(cè)和ALL的免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因重排PCR檢測(cè)，敏感性均可達(dá)到10-4。多個(gè)國(guó)際著名兒童白血病研究中心的結(jié)果提示，在誘導(dǎo)治療早期、誘導(dǎo)治療結(jié)束時(shí)、3個(gè)月或更晚，MRD高水平與預(yù)后高度相關(guān)，并因此將治療早期MRD評(píng)估作為分層治療強(qiáng)度選擇的一個(gè)必要標(biāo)準(zhǔn)，在誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)及以后，多數(shù)以10-4為判斷值。

二、急性髓細(xì)胞白血病的微小殘留病監(jiān)測(cè)

AML中可以用于殘留病并監(jiān)測(cè)的特異性標(biāo)志如下。

1．特異性融合基因 PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-AF6、MLL-AF9、MLL-AF10、MLL-ENL、MLL-ELL等融合基因直接和AML的發(fā)病有關(guān)，它們不但是影響預(yù)后的重要因素，同時(shí)又是MRD的特異標(biāo)志。雖然也有報(bào)道在正常人中也可以表達(dá)少量的融合基因，但基本不影響它們對(duì)疾病狀態(tài)的評(píng)價(jià)。但融合基因作為MRD標(biāo)記的最大缺陷是其較窄的覆蓋面。目前任何一種融合基因的發(fā)生率均不超過(guò)10%，而且所有可以發(fā)現(xiàn)融合基因或細(xì)胞遺傳學(xué)異常的AML占所有AML病例的1／2左右。這種覆蓋范圍的缺陷限制了它在AML微小殘留病灶檢測(cè)中的應(yīng)用。

2．AML相關(guān)的基因突變 除了上述的融合基因，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)許多基因突變?cè)贏ML的發(fā)病環(huán)節(jié)中起著重要作用，而且對(duì)AML預(yù)后發(fā)生重要的影響。目前，備受關(guān)注的基因突變有MLL-PTD、FLT3-ITD、NPM1和CEBPA。尤其是FLT3-ITD和NPM1突變，分別預(yù)示不良預(yù)后和良好預(yù)后，在成年人AML中發(fā)生率高達(dá)25%，在細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML中發(fā)生率高達(dá)40%～60%。但文獻(xiàn)報(bào)道，兒童AML的發(fā)生率較低，其中NPM1突變的發(fā)生率不及10%。最近，我們?cè)谥袊?guó)兒童AML的研究數(shù)據(jù)顯示，NPM1突變的發(fā)生率高達(dá)近40%，F(xiàn)LT3-ITD可以在1／3的兒童AML中發(fā)現(xiàn)。所以就其覆蓋面來(lái)說(shuō)，這些基因是AML殘留病灶的較好的分子標(biāo)記。我們結(jié)合PLM／RARA、AML1／ETO和MLL-PTD、FLT3-ITD、NPM1，發(fā)現(xiàn)超過(guò)3／4的AML可以有至少一種分子事件。但是，如果要將這些基因突變作為MRD的標(biāo)志尚需考慮兩個(gè)問(wèn)題：①突變的穩(wěn)定性，即在白血病治療過(guò)程中這些基因組的改變是否始終保持不變。近來(lái)的研究顯示，NPM1和CEBPA突變的穩(wěn)定性很好，居大多數(shù)病例在白血病復(fù)發(fā)時(shí)其分子改變和初發(fā)時(shí)相同，這種符合率均在90%以上。但FLT3-ITD的穩(wěn)定性在各組研究中的結(jié)果不盡相同，復(fù)發(fā)前后的符合率為80%～95%，但仍然不失為一種有用的MRD標(biāo)記。②突變的多樣性，所有這些基因突變的類(lèi)型及發(fā)生位點(diǎn)變異較大，尤其是CEBPA的突變熱點(diǎn)較為分散，很難用一種通用的方法來(lái)檢出每一個(gè)基因的所有突變。

3．基因的異常表達(dá) 最常用于AML殘留病灶檢出的基因表達(dá)異常是WT1，此外有EV1、PRAME等。它們?cè)贏ML中的覆蓋率各不相同，但據(jù)研究顯示，它們的穩(wěn)定性非常好。AML常見(jiàn)的異常分子標(biāo)記及發(fā)生頻率（表4-6）。

4．細(xì)胞免疫標(biāo)記的異常 與ALL相似，AML同樣利用LAIP，這些LAIP可分為4大類(lèi)（表4-7）：①交叉系表達(dá)抗原；②抗原高表達(dá)；③抗原表達(dá)缺失；④抗原不同步表達(dá)。

表4-6　AML常見(jiàn)的異常分子標(biāo)記及其頻率

表4-7　AML相關(guān)免疫標(biāo)型組合分類(lèi)

“＋＋”．過(guò)表達(dá)；“＋”．表達(dá)；“-”．不表達(dá)

AML的LAIP更為復(fù)雜，這是由于AML患者個(gè)體之間表型存在高度異質(zhì)性，有些病例所有白血病細(xì)胞可能都可以歸于一類(lèi)LAIP，但其他病例則可能僅部分白血病細(xì)胞可以歸于同一類(lèi)LAIP。白血病細(xì)胞是否能歸于同一類(lèi)LAIP取決于與正常骨髓細(xì)胞相比，其LAIP異常程度。因此對(duì)于缺乏可供選擇的LAIP組合的AML患者，其原因可能為：①僅部分細(xì)胞可以歸于某一LAIP；②所有白血病細(xì)胞均能歸于同一LAIP，但由于與正常細(xì)胞免疫表型重疊而缺乏敏感性和特異性；③缺乏可供MRD監(jiān)測(cè)的異常免疫表型。早期的研究顯示，成人AML的MRD覆蓋率在75%左右，兒童AML的覆蓋率在85%左右。最近的報(bào)道顯示，可用于兒童AML的MRD診斷的LAIP可以高達(dá)90%以上。但是由于許多AML的LAIP和正常細(xì)胞的表型差別較小，MRD陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)除個(gè)別組合可達(dá)0．01%外，大多以0．1%（10-3）作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。此外，對(duì)AML患者做MRD檢測(cè)時(shí)，其LAIP可能會(huì)因?yàn)橹委煹纫蛩赜绊懓l(fā)生改變，從而失去對(duì)復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的意義，使其對(duì)疾病預(yù)后判斷的價(jià)值受到限制。

三、實(shí)體瘤的微小殘留病灶

實(shí)體瘤的MRD可以有兩層意義。一是實(shí)體瘤塊病灶的殘留，二是腫瘤細(xì)胞的骨髓浸潤(rùn)，后者也可稱為微小浸潤(rùn)。前者主要依靠影像學(xué)檢查和腫瘤殘留的病理檢查，后者主要利用腫瘤細(xì)胞特異的異常標(biāo)志。

1．淋巴瘤的骨髓微小浸潤(rùn) 淋巴瘤的分期是淋巴瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)也是治療方案選擇的基礎(chǔ)，而骨髓浸潤(rùn)是淋巴瘤分期的最主要指標(biāo)之一。當(dāng)淋巴瘤發(fā)生骨髓浸潤(rùn)時(shí)其微小病灶檢測(cè)的基本原理和方法與ALL相似。

2．神經(jīng)母細(xì)胞瘤

（1）基因組異常及基因的異常表達(dá)：與血液淋巴系統(tǒng)腫瘤不同，至今人們尚沒(méi)有明確發(fā)現(xiàn)具有高覆蓋率的可以作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留病監(jiān)測(cè)的融合基因和異常表達(dá)基因。

（2）特異表達(dá)的免疫標(biāo)記：通過(guò)多方研究，在NB-MRD監(jiān)測(cè)研究中兩種抗原備受關(guān)注，即雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂（GD2）和CD45／CD56／CD81組合。前者只在大部分神經(jīng)母細(xì)胞中表達(dá)，而且只在未分化的腫瘤細(xì)胞中有強(qiáng)烈的表達(dá)，一旦腫瘤細(xì)胞發(fā)生分化其表達(dá)也就逐漸消失。GD2也同時(shí)表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、橫紋肌肉瘤細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞上。但GD2不在造血細(xì)胞中表達(dá)，所以理論上GD2的特異單抗非常適合于骨髓中神經(jīng)母細(xì)胞瘤的MRD。但是由于GD2以隨著腫瘤細(xì)胞的分化發(fā)生抗原消退所以可以造成檢測(cè)的假陰性，不過(guò)這種假陰性發(fā)生在分化的腫瘤細(xì)胞上，其臨床意義相對(duì)較小。另一方面，GD2可以從神經(jīng)母細(xì)胞上脫落，脫落在血漿中的可溶性抗原可以被骨髓中的巨噬細(xì)胞吞噬或者非特異地吸附到造血細(xì)胞表面造成假陽(yáng)性。CD45／CD56／CD81組合中，CD81是細(xì)胞信號(hào)復(fù)合物的組成部分，廣泛分布于大多數(shù)的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞表面，但中性粒細(xì)胞、血小板不表達(dá)CD81，而人類(lèi)NB細(xì)胞株也表達(dá)CD81。CD56是一種神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，適度表達(dá)于PB大顆粒淋巴細(xì)胞的亞群上及所有以NK細(xì)胞激活的細(xì)胞，人類(lèi)NB細(xì)胞株可表達(dá)該神經(jīng)細(xì)胞黏附分子。CD45是白細(xì)胞共同抗原，所有造血細(xì)胞均表達(dá)，但人類(lèi)NB細(xì)胞株不表達(dá)。因此選擇不表達(dá)CD45，而表達(dá)CD81和CD56（CD45-FITC／CD81-PE／CD56-PECy5單抗組合）可除外淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、NK細(xì)胞等血細(xì)胞，而明確為表達(dá)CD81和CD56的神經(jīng)元細(xì)胞，在兒童中主要為神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，適合于作為骨髓微量腫瘤浸潤(rùn)的監(jiān)測(cè)。目前尚不明確該組合是否也適合于原始神經(jīng)外胚葉性腫瘤（PNET）。