1．檢驗?zāi)康?/p>

檢測血清中ABO及Rh血型抗體效價，為新生兒溶血病的診斷和預(yù)防、骨髓移植和干細胞移植后供者細胞存活狀態(tài)評價提供依據(jù)。

2．檢驗原理

ABO及Rh血型抗體在一定介質(zhì)條件下與相應(yīng)紅細胞抗原結(jié)合后會出現(xiàn)紅細胞凝集，不同的凝集強度會間接反映出血型抗體結(jié)合抗原的能力（效價）。不同標本在血型抗體反應(yīng)活性均較高的情況下都會使相應(yīng)紅細胞出現(xiàn)最強凝集（＋＋＋＋），無法真正區(qū)分不同標本間血型抗體結(jié)合抗原的能力差異。通過將血清（或血漿）連續(xù)倍比稀釋，觀察稀釋后血清與相應(yīng)抗原紅細胞凝集反應(yīng)強度，能夠發(fā)現(xiàn)不同標本之間血型抗體反應(yīng)活性的差異或同一受檢者不同時期血型抗體反應(yīng)活性的變化情況。在確定統(tǒng)一凝集強度的情況下[最后一個（＋）]，產(chǎn)生凝集的最高稀釋度的倒數(shù)即為該標本的抗體效價。

3．適用范圍

3.1 ABO血型抗體效價測定

3.1.1 孕婦血型抗體效價檢測，用于ABO血型新生兒溶血病風(fēng)險評估；

3.1.2 骨髓移植、干細胞移植后供者細胞存活狀態(tài)（嵌合）評價。

3.2 Rh血型抗體效價測定　用于明確產(chǎn)生Rh血型系統(tǒng)不規(guī)則抗體的孕婦,以動態(tài)評估發(fā)生Rh血型新生兒溶血病的風(fēng)險，主要測定IgG類Rh抗體。

4．設(shè)備性能參數(shù)

參見KA-2200血清學(xué)專用離心機、達亞美ID離心機、達亞美ID孵育器、強生Othro Biovue 離心機使用說明書。

5．器材與試劑

5.1 器材：KA-2200血清學(xué)專用離心機、B 600-A型低速離心機、達亞美ID離心機、達亞美ID孵育器、強生Othro Biovue 離心機、塑料軟試管、塑料硬質(zhì)試管（75 mm×12 mm）、試管架、一次性塑料滴管、移液器、一次性移液槍頭。

5.2 試劑：DiaMed Coombs卡、Othro Biovue Coombs卡、生理鹽水、抗IgG抗體試劑（市售單克?。?、凝聚胺試劑、2-Me、致敏的陽性對照細胞（自制）。

6．樣本要求

EDTA-K3或EDTA-K2抗凝全血≥3 ml，經(jīng)B 600-A型離心機1 760 r/min離心5 min，離心后無溶血及明顯乳糜。

7．校準步驟

嚴格參照KA-2200血清學(xué)專用離心機、達亞美ID離心機、達亞美ID孵育器、強生Othro Biovue離心機使用說明書執(zhí)行。

8．操作程序

8.1 ABO血型抗體效價測定

8.1.1 IgM類抗體測定

8.1.1.1 血清（或血漿）連續(xù)倍比稀釋　排列10支試管按順序編號。每管用加樣槍各加生理鹽水100μl，在第1管中加入待檢血清100μl，混勻后移出100μl轉(zhuǎn)至第2管，以同樣操作稀釋至第10管，從第10管吸出100μl暫時保留在另一試管中，以備必要時作進一步稀釋。這樣從第1管到第10管的血清稀釋度依次是1∶2，1∶4，…，1∶1 024。

8.1.1.2 加紅細胞懸液　在每管稀釋后的血清（或血漿）各加3%相應(yīng)紅細胞懸液100μl，混勻（如待檢血清抗體為抗A，則加入A型標準紅細胞懸液；如待檢血清抗體為抗B，則加入B型標準紅細胞懸液；如待檢血清中既有抗A又有抗B，則倍比稀釋兩份血清，一份加入A型標準紅細胞懸液，另一份加入B型標準紅細胞懸液）。

8.1.1.3 離心與結(jié)果觀察　使用KA-2200臺式離心機1 000 r/min離心15 s后觀察結(jié)果。以肉眼觀察到最后一個（＋）的凝集管作為判斷的終點，終點血清稀釋度的倒數(shù)即為其IgM類抗體的效價（Titer），或稱滴度。

8.1.2 IgG類抗體效價滴定

8.1.2.1 IgM類抗體的破壞　須取適量血清或血漿（0.5或1.0 ml）加等體積2-Me溶液（也可選用DDT試劑）混合，封口，置37℃水浴箱孵育30 min。

8.1.2.2 血清（或血漿）連續(xù)倍量稀釋：操作步驟同8.1.1.1。

8.1.2.3 效價滴定操作。

8.1.2.3.1 經(jīng)典間接抗人球法

在倍比稀釋血清或血漿中加入3%對應(yīng)的A型（或B型）紅細胞懸液50μl，37℃水浴30 min；

生理鹽水洗滌三遍，最后一遍在吸水紙上控干，加抗IgG抗人球蛋白試劑血清1滴，血型血清學(xué)專用離心機1 000 r/min離心15 s后觀察并記錄結(jié)果。

8.1.2.3.2 凝聚胺法

在倍比稀釋血清或血漿中加入3%對應(yīng)的A型（或B型）紅細胞懸液50μl混勻；

各試管分別加LIM液0.65 ml，充分混合均勻后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均勻；

血型血清學(xué)專用離心機Ⅱ擋（1 000 r/min，15 s）離心，把上清液倒掉，不要瀝干，讓管底殘留約0.1 ml液體；

輕輕搖動試管，目測紅細胞有無凝集，如無凝集，則必須重做以上步驟；

最后加入Resuspending液2滴，輕輕轉(zhuǎn)動試管混合并同時觀察結(jié)果。如果在30 s～1 min內(nèi)凝集散開，為陰性；如凝集不散開，則為紅細胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，需要具體判斷凝集強度。

8.1.2.3.3 DiaMed Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的錫箔，在每一個反應(yīng)孔下做好標記；

依次在每孔中加入0.8%的A型（或B型）紅細胞懸液50μl和倍比稀釋后血清或（血漿）25μl；

37℃孵育15 min，達亞美專用離心機85 r/min離心10 min 后判斷結(jié)果。

8.1.2.3.4 Autovue Innova Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的錫箔，在每一個反應(yīng)孔下做好標記；

先向每個反應(yīng)柱內(nèi)加入50 μl BILSS液，再分別向反應(yīng)柱內(nèi)加入10μl 3%A型（或B型）紅細胞懸液，最后向反應(yīng)柱內(nèi)加入40μl患者血清或血漿；

觀察柱中的反應(yīng)物各組分是否混勻，必要時輕彈幾下微柱，使反應(yīng)物充分混勻；

37℃孵育10 min，用Biovue離心機雙向離心5 min，離心必須在加樣后30 min內(nèi)進行；

從微柱正反兩面判讀并記錄結(jié)果。

8.1.2.4 結(jié)果判定

通常每種方法都是以肉眼觀察到最后一個（＋）的凝集作為判斷的終點，終點血清（或血漿）稀釋度的倒數(shù)為效價（Titer），或稱滴度。

8.2 IgG類Rh血型抗體效價測定

8.2.1 IgM類Rh抗體的破壞

如果血清中同時含有IgM類Rh同型抗體,需要先將IgM類抗體破壞,操作步驟同 8.1.2.1;

8.2.2 血清（或血漿）連續(xù)倍量稀釋：操作步驟同8.1.1.1；

8.2.3 IgG類Rh血型抗體效價滴定操作

8.2.3.1 經(jīng)典間接抗人球法

在倍比稀釋血清或血漿中加入3%對應(yīng)的O型D陽性（或純合E、純合e、純合C、純合c）紅細胞懸液50μl，37℃水浴30 min；

生理鹽水洗滌三遍，最后一遍在吸水紙上控干，加抗IgG抗人球蛋白試劑血清1滴，血型血清學(xué)專用離心機1 000 r/min離心15 s后觀察并記錄結(jié)果。

8.2.3.2 凝聚胺法

在倍比稀釋血清或血漿中加入3%對應(yīng)的O型D陽性（或純合E、純合e、純合C、純合c）紅細胞懸液50μl混勻；

各試管分別加LIM液0.65 ml，充分混合均勻后，再各加Polybrene溶液2滴，并混合均勻；

血型血清學(xué)專用離心機Ⅱ擋（1000 r/min，15 s）離心，把上清液倒掉，不要瀝干，讓管底殘留約0.1 ml液體；

輕輕搖動試管，目測紅細胞有無凝集，如無凝集，則必須重做以上步驟；

最后加入Resuspending液2滴，輕輕轉(zhuǎn)動試管混合并同時觀察結(jié)果。如果在30 s～1 min內(nèi)凝集散開，為陰性；如凝集不散開，則為紅細胞抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，需要具體判斷凝集強度。

8.2.3.3 DiaMed Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的錫箔，在每一個反應(yīng)孔下做好標記；

依次在每孔中加入0.8%的O型D陽性（或純合E、純合e、純合C、純合c）紅細胞懸液50μl和稀釋后血清或（血漿）25μl；

37℃孵育15 min，達亞美專用離心機85 r/min離心10 min后判斷結(jié)果。

8.2.3.4 Autovue Innova Coombs卡式法

撕掉Coombs卡上的錫箔，在每一個反應(yīng)孔下做好標記；

先向每個反應(yīng)柱內(nèi)加入50μl BILSS液，再分別向反應(yīng)柱內(nèi)加入10μl 3% O型D陽性（或純合E、純合e、純合C、純合c）紅細胞懸液，最后向反應(yīng)柱內(nèi)加入40 μl患者血清或血漿；

觀察柱中的反應(yīng)物各組分是否混勻，必要時輕彈幾下微柱，使反應(yīng)物充分混勻；

37℃孵育10 min，用Biovue離心機雙向離心5 min，離心必須在加樣后30 min內(nèi)進行；

從微柱正反兩面判讀并記錄結(jié)果。

8.2.4 結(jié)果判定

同8.1.2.4。

8.3 檢驗結(jié)果的輸入與確認

8.3.1 啟動“檢驗程序”，輸入用戶名及口令后，進入檢驗程序。

8.3.2 結(jié)果的輸入　單擊“檢驗”菜單，選擇“檢驗結(jié)果錄入\修改”，通過申請序號進行檢驗結(jié)果的錄入及修改。

8.3.3 檢驗結(jié)果的確認　檢驗結(jié)果應(yīng)由實驗室負責(zé)人或授權(quán)人員進行確認，方法為單擊“結(jié)果處理”菜單，選擇“報告確認”進入結(jié)果確認，通過選擇“工作單元”、“報告日期”、“單張”或“批量”后，按“提取”鍵提取已經(jīng)傳輸或錄入的檢驗結(jié)果，按“確認”鍵進行確認。

9．質(zhì)量控制

9.1 室內(nèi)質(zhì)量控制　凝聚胺法、經(jīng)典抗人球蛋白法、卡式抗人球蛋白法室內(nèi)質(zhì)控均參照《輸血相容性檢測室內(nèi)質(zhì)量控制管理程序》進行。

9.2 室間質(zhì)量評價　抗體效價測定目前尚無統(tǒng)一的室間質(zhì)量評價活動。

10．干擾因素

IgM類抗體破壞不完全會在一定程度上影響IgG類抗體效價結(jié)果的判斷。

11．結(jié)果計算及測量不確定度

不適用。

12．生物參考區(qū)間

不適用。

13．檢驗結(jié)果可報告區(qū)間

不適用。

14．警告/危急值

14.1 ABO血型不合時孕婦產(chǎn)前ABO抗體效價一般以64作為臨界值，效價≥64認為可能有臨床意義，需要進行動態(tài)觀察抗體效價的變化，如果兩次檢測效價增加2倍或更多，被認為是發(fā)生新生兒溶血病的指征，應(yīng)該進行更緊密的檢測，以便及時采取治療措施。

14.2 RhD血型不合時孕婦產(chǎn)前ABO抗體效價一般以16作為臨界值，效價≥16認為有臨床意義，需要進行動態(tài)觀察抗體效價的變化。

15．實驗室解釋

孕婦體內(nèi)血型抗體效價的升高提示發(fā)生新生兒溶血病的幾率增大，需要進行連續(xù)動態(tài)監(jiān)測。骨髓移植或干細胞移植患者移植后ABO血型抗體效價的改變可以反映供者細胞的存活、增殖情況。

16．安全性預(yù)警措施

16.1 實驗室及工作人員一般安全防護措施參見《實驗室安全與衛(wèi)生管理程序》。

16.2 發(fā)生血液標本溢出時，應(yīng)參照《實驗室消毒與清潔程序》對污染的環(huán)境進行消毒處理。

16.3 操作人員發(fā)生職業(yè)暴露時，應(yīng)參照《實驗室職業(yè)暴露預(yù)防與處理程序》及時進行相應(yīng)處理。

16.4 在儀器運轉(zhuǎn)過程中，勿觸及樣品針、移動的傳輸裝置等，避免造成人身傷害。禁止觸摸儀器密封面板內(nèi)的電路，防止造成電擊損傷。

16.5 對突發(fā)傳染性疾病的血液標本應(yīng)啟動特殊的安全防護程序。

17．變異潛在來源

不適用。

18．ABO及Rh血型抗體效價測定試驗特別注意事項

18.1 在抗體倍比稀釋過程中，不更換槍頭，每吸完一次可用紙巾稍稍吸干。這與更換槍頭的結(jié)果將不一樣。

18.2 如果一種血清要分別和幾種紅細胞作用，要將血清做總稀釋，然后分別移同樣的實驗容量到所需的試管中，這樣會縮小誤差。18.3 看結(jié)果時可能出現(xiàn)低稀釋度的凝集強度比高稀釋度的要弱，這是前帶現(xiàn)象。18.4 對1份血清如果重復(fù)滴定，結(jié)果可能不一樣，如果只有一個稀釋度的差別，即前后1管之差，屬正常誤差范圍。

18.5 測定IgG類抗體效價時，用等量巰基試劑破壞IgM類抗體時，血清已被稀釋，計算效價時要加一個稀釋度。

18.6 破壞后的血清倍比稀釋加入相應(yīng)的細胞后，立即離心肉眼觀察，記錄結(jié)果，然后再繼續(xù)IgG抗體檢測的操作，同樣記錄結(jié)果。

18.7 為避免不同人操作造成的一些誤差，保證結(jié)果的連續(xù)性，效價測定一概用加樣槍加樣。

18.8 為了解抗體的效價變化而連續(xù)取樣檢查，最好將標本冰凍保存，以便與以后的標本進行比較對照。

19．報告時間

ABO及Rh血型抗體效價測定試驗，一般于檢測當(dāng)日下午17點前出結(jié)果并上傳HIS系統(tǒng)。

20．參考文獻

[1] DiaMed Coombs卡、Othro Biovue Coombs卡、生理鹽水、抗IgG抗體試劑

（市售單克隆）、凝聚胺試劑、2-Me試劑使用說明書．

[2] 臨床輸血技術(shù)規(guī)范．中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司.北京，2000．

[3] 中國輸血技術(shù)操作規(guī)程（血站部分）．中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)政司．天津，

1997.