創(chuàng)傷、先天性異常和頭頸、四肢的腫瘤切除等原因導致軟組織缺乏而表現(xiàn)出輪廓塌陷。這種美容方面的缺陷嚴重影響了患者的情感感受。目前，恢復軟組織容積和輪廓缺陷的標準方法是自體脂肪移植及脂肪單細胞懸液注射，分別通過術前手術直接切除和脂肪抽吸術獲得。但自體脂肪移植存在矯枉過正、移植成活率低、移植物被吸收導致容積減少40%～60%而需要重復手術的缺陷。脂肪單細胞懸液注射創(chuàng)傷大（90%細胞受損）、異物反應、炎癥反應明顯，最終注射的脂肪被吸收導致失敗。一些商品化的天然、合成或兩者的混合材料也被用來代替脂肪組織，如礦物或植物油、石蠟、脫細胞真皮基質（Allo－ Derm）、自體或異體真皮組織、纖維蛋白凝膠（Fibrel）、透明質酸凝膠（Hylaform）、牛真皮膠原（Zyderm）、硅樹脂、聚四氟乙烯、交聯(lián)的聚二甲基硅氧烷（Bioplastique）等，雖然改善了患者的缺陷，但其遠期結果不定，還可能發(fā)生纖維包裹攣縮、變態(tài)反應、機械耐力不理想、變形、移位、遠期吸收消失等缺陷。因此，目前的方法效果有限，也不適于諸如乳腺切除后等大容積軟組織缺失的修復。組織工程技術重建的脂肪組織可能是一個可選擇的替代方案。脂肪組織工程的原理與皮膚組織工程基本相似，包括4個完整的部分，即細胞、三維支架、組織誘導物質和相應的培養(yǎng)方法（圖18－1）。

圖18－1　脂肪組織工程原理

目前技術構建的三維細胞－支架脂肪生成重組體，通過活體移植或體外激素刺激獲得脂肪替代物。但活體誘導的維持時間和體外誘導的組織黏合性還不完全令人滿意。

一、脂肪組織工程的種子細胞

雖然脂肪由多種不同細胞所組成，目前組織工程方法中所用細胞無一例外地選擇脂肪細胞。

（一）成熟脂肪細胞

成熟脂肪細胞是脂肪組織的主要細胞，屬于終末分化細胞，盡管在合適培養(yǎng)條件下，其增生能力相當可觀，但由于其漂浮性和脆性大、機械抵抗力低，不能使用常規(guī)的分離、培養(yǎng)技術。因而不是脂肪組織工程的首選種子細胞。

（二）前脂肪細胞

前脂肪細胞（preadipocytes），也稱脂肪前體細胞（adipocyte precursor cells）。存在于脂肪組織的間質血管碎片（stromal－vascular fraction，SVF）中。有學者認為它與脂肪間充質干細胞是兩類不同的細胞。脂肪細胞的發(fā)育過程為多能干細胞→前脂肪細胞→多室脂肪細胞→成熟脂肪細胞。因此認為，前脂肪細胞作為一種生成脂肪細胞的過渡細胞，雖具有一定的增殖潛力和脂肪生成誘導分化能力，但缺乏多向分化潛力，一般不表達干細胞表面標志。但目前國內外脂肪組織工程文獻中的前脂肪細胞也指脂肪來源的間質細胞和其他一些細胞系細胞。

前脂肪細胞是成纖維細胞樣細胞，不含脂滴，體積小，有促血管生成特性，比成熟的脂肪細胞更能耐受缺血、創(chuàng)傷和細胞培養(yǎng)操作中的機械力，以常規(guī)方法操作也更容易培養(yǎng)、擴增。一定條件下，在體內與體外均可以增殖分化為成熟脂肪細胞。已經證實，用這種細胞構建的組織工程脂肪替代物移植后成活率高，遠期效果好，吸收少。因而是組織工程脂肪較理想的種子細胞。但是前脂肪細胞體外培養(yǎng)時易老化，且隨著傳代次數(shù)的增加，會散失分化能力，從而限制了它的應用。目前報道的研究中主要使用吸脂或脂肪活檢組織分離人前脂肪細胞。其基本方法是將吸脂術或活檢獲得的脂肪組織用PBS仔細沖洗以去除血細胞，然后剪碎，用0．075%～0．1%Ⅰ型膠原酶37℃水浴中振搖消化30～60min，含10%胎牛血清的M199重懸，4℃、200g離心5min，去上清，M199洗滌2次，1×103個／cm2接種培養(yǎng)。

不同解剖部位、性別、年齡及是否絕經等對細胞的品質有影響。另外，前脂肪細胞的黏附、活力和對不同微環(huán)境的反應仍需要進一步研究。

從切除脂肪墊的間質血管成分分離的這類細胞常常存在細胞異質性、低增生率和供體部位依賴的分化能力等不一致性?；A研究中還常使用鼠3T3－L1細胞系，即特征性的前脂肪細胞系，可以避免上述缺陷，使研究條件高度可重復。另外，3T3－F442A細胞系有在活體研究中使用的報道。

（三）脂肪間充質干細胞

它是與骨髓基質干細胞相似的具有分化為成熟脂肪細胞的一類成體干細胞，在脂肪組織中的含量達2%，數(shù)量可觀。文獻中名稱復雜，有脂肪來源的間質細胞（adipose－derived stromal cells，ASCs）、脂肪來源的間充質干細胞（adipose－derived mesenchymal stem cells，ASCs）、脂肪來源的干細胞（adipose－derived stem cells，ADSCs）、脂肪組織源性干細胞（adipose tissue－derived stem cells，ADSCs）、脂肪源性中胚層干細胞（adipose－derived mesodermal stem cells，ADMSCs）等。文獻均避免這些不同稱謂的比較，但從組織工程細胞來源的角度講，這些概念有不同的細微差別，但其本質可能都是不同分離培養(yǎng)方法獲得的不同純度的脂肪間充質干細胞。

它具有廣泛的多向分化潛能，在不同的環(huán)境和相應細胞因子的作用下能向脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、神經細胞及心肌細胞定向誘導分化。原代培養(yǎng)有脂滴形成，傳代后沒有脂滴形成，并隨著體外培養(yǎng)時間的延長，脂肪干細胞的間質細胞相關表型逐漸增加，表達間充質干細胞的標志CD29、CD44、CD59、CD105（SH2）、SH3、CD166等，但不表達CD106。目前分離方法獲得的細胞還可能混雜不同比例的雜細胞成分，如周皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、Fb等。國內有研究表明，這種細胞表達一些內皮細胞標志，如Ⅷ因子免疫細胞化學染色約95%細胞呈強陽性、透射電鏡見Weibel－Palade小體。

脂肪間充質干細胞來源相對容易，體外能大量擴增，不易老化，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)160代后仍保持脂肪生成能力。因而是非常有前景的脂肪組織工程種子細胞。分離培養(yǎng)方法與前脂肪細胞大同小異。將吸脂術或活檢獲得的脂肪組織剪碎，0．075%Ⅰ型膠原酶37℃消化60min，隨后，0．25%胰蛋白酶消化10min。10%牛血清溶液中和胰蛋白酶、多次離心洗去膠原酶，過濾獲得細胞沉淀物，離心洗滌后，用紅細胞裂解液（NH4Cl溶液）室溫作用10min。洗滌、離心后，以8×105個／cm2接種，含10%胎牛血清、100U／ml青霉素、25mg／ml慶大霉素的DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基培養(yǎng)。傳代時接種密度為8×103個／cm2。有人發(fā)現(xiàn)，在體外的脂肪形成潛力和重建脂肪替代物的能力方面，通過吸脂術獲得的脂肪間充質干細胞比手術切除分離的脂肪間充質干細胞要好。

（四）其他干細胞衍生的脂肪組織前體細胞

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BSCs）是研究最廣泛的成體干細胞，具有多潛能分化的特點。體外分離、擴增較容易，也是脂肪組織工程種子細胞的一種選擇，有多篇文獻報道。胚胎干細胞、臍血間充質干細胞、胎肝間充質干細胞也有被誘導轉化為脂肪細胞的報道。

二、脂肪組織工程的支架材料

脂肪組織工程擁有恢復組織缺失容積和功能的潛能，這依賴于前脂肪細胞黏附到合適的支架。前脂肪細胞是錨著依賴細胞，支架必須適于細胞黏附、遷移和增生。支架材料的重要性在于為脂肪種子細胞提供黏附表面，模擬一定的外形，引導組織再生，并便于細胞－支架重組體的操作?？梢杂脕碜鲋窘M織工程三維支架的材料有天然細胞外基質和可生物降解合成聚合物，它們可以被植入或注射到需要部位。應綜合考慮力學特性、降解性質、免疫原性、細胞對材料的反應性、臨床易操作性、價格等因素來選擇支架。

（一）天然細胞外基質支架

已報道使用的天然細胞外基質有膠原凝膠、膠原海綿、膠原－殼多糖海綿、吸收性明膠海綿、Matrigel、共價連接細胞黏附肽RGD的藻酸鹽、纖維蛋白凝膠、蠶絲蛋白三維支架、透明質酸酯衍生物多孔支架（HYAFF11）、人脫細胞胎盤基質、透明質酸凝膠等。大多數(shù)研究在活體進行，在植入點有脂肪組織形成。只有少數(shù)工作使用這些基質做三維培養(yǎng)，這些體外研究僅證明前脂肪細胞向含脂質的脂肪細胞轉化，而并未獲得黏合性良好的脂肪組織樣結構，原因是體外無法模擬脂肪生成的生理環(huán)境。膠原來源支架細胞黏附性很好，但移植后存在的時間短，而蠶絲蛋白支架可以更長的時間維持軟組織形狀的完整性。

Kimura Y等將黏附有人前脂肪細胞的含緩釋bFGF的明膠微球摻和到膠原海綿細胞支架中，移植到裸鼠背部皮下，6周后海綿支架中有脂肪組織形成。觀察到細胞數(shù)量和bFGF濃度對脂肪組織形成的范圍呈拋物線形影響，每個移植點細胞數(shù)為1．0×105個和bFGF濃度1mg是高峰。單獨移植黏附前脂肪細胞的含緩釋bFGF的明膠微球沒有觀察到脂肪生成。

（二）可生物降解聚合物支架

合成材料可以不受限制地重復制造，在脂肪組織形成研究中比天然細胞外基質更具有可重復性。主要使用生物可降解的合成泡沫，如PLGA、PLA，聚乙烯乙二醇雙丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEDGA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乙烯對苯二酸酯（polyethylene terephthalate，PET）也有報道。接種前脂肪細胞的PLGA在活體能生成脂肪墊，但其維持時間尚不能令人滿意。另外，與天然細胞外基質類似，體外誘導的脂肪替代物也缺乏組織黏合性。而且，因其過硬而可能引起患者不適，多數(shù)情況下它不是理想的選擇，如做乳腺重建的支架。更恰當?shù)倪x擇可能是生物可降解性聚合物毛氈（biodegradable polymer felt）。

通過賦予PLGA攜帶緩釋IGF－Ⅰ與bFGF，對重建脂肪中的細胞類型有顯著影響。另外，在材料表面涂覆纖維連接蛋白或含精氨酸、甘氨酸及天冬酰胺組成的RGD短肽，調節(jié)細胞識別和吸附，影響內皮細胞遷移增加血管形成，使脂肪生成增加。

可生物降解微球可同時攜帶細胞和作為藥物傳遞載體。已經證實，在不停攪動的生物反應器內，前脂肪細胞能黏附到微載體珠上，可抵抗生物反應器的低剪切力并能生長、分化。微球還能攜帶脂肪生成因子或血管生成因子。有研究表明，PLGA攜帶內皮細胞因子，持久釋放達21d。微球直徑可能影響前脂肪細胞的增生能力和脂肪生成能力。Choi YS等將黏附兔間充質干細胞的不同直徑可注射PLGA微球在脂肪生成培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)直徑75～100μm微球組上的細胞增生和脂肪分化最佳；注射到裸鼠頸部4周后，直徑100～150μm微球組形成的脂肪墊組織學最像裸鼠自身的脂肪組織。

有學者在不可生物降解合成材料聚四氟乙烯支架表面應用不同的細胞外基質成分（如膠原），前脂肪細胞均可吸附到支架上并增殖。

水凝膠性質的天然或合成材料可以通過溫度或化學方式控制其凝膠固化作用，而且細胞能均勻分布在材料中，可以很方便地以液態(tài)注射到需要的部位?？捎糜谲浗M織缺失的填充及乳房造型。透明質酸凝膠、藻酸鹽凝膠可能是乳房脂肪重建支架的一個選擇。

三、脂肪生成誘導物質

為了重建脂肪組織的天然結構，前脂肪細胞必須轉化成分化的表型。前脂肪細胞－支架重組體的微環(huán)境將影響前脂肪細胞的分化和脂肪組織形成率。內源性和外源性生長因子、PO2、pH、細胞外基質上的黏附分子、支持細胞、微動力影響脂肪形成。已報道影響前脂肪細胞分化為脂肪細胞的化學因子中，糖皮質激素、生長激素、IGF－Ⅰ、胰島素、前列腺素、甲狀腺素促進分化；EGF、TNF－α、IL－11、TGF－α、TGF－β、γ干擾抑制脂肪分化；aFGF、bFGF、PDGF等因為沒有闡明是直接還是通過血管生成間接影響前脂肪細胞的分化，結論相互有沖突。

目前實際應用中激活前脂肪細胞分化的方法，一是將構建的前脂肪細胞－支架重組體植入生理環(huán)境（活體），二是使用含胰島素、糖皮質激素和提升細胞內第二信使cAMP水平的因子的培養(yǎng)基（體外）。有時還要添加激活轉錄因子過氧化物酶增殖激活受體－γ（PPARγ）的物質如吲哚美辛、曲格列酮（rosiglitazone）以促進成脂作用。體外常用的脂肪細胞誘導培養(yǎng)液為含10μg／ml胰島素、1μmoL／L地塞米松、0．5mmoL／L異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、200μmoL／L吲哚美辛、100ml／L胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素、2mmoL／L谷氨酰胺的DMEM／F12培養(yǎng)基。另一報道的脂肪生成誘導雞尾酒配方為：100nmol／L胰島素、0．2nmol／L T3、1μmol／L地塞米松、0．25 mmol／L IBMX和1μM曲格列酮。

Vashi AV等在自制的小鼠組織工程小室模型中，將FGF－2明膠緩釋微球混入Matrigel或Ⅰ型膠原凝膠，注入移植小室，6周后，均形成新的脂肪組織（無細胞脂肪組織工程技術）。Stillaert F等將添加FGF－2、培養(yǎng)的人間質血管碎片（SVF）細胞、Matrigel充滿小室，移植到小鼠上腹部。通過研究移植小室下新形成脂肪的來源，發(fā)現(xiàn)SVF的主要功能是產生誘導因子誘導形成新脂肪，而不是提供脂肪細胞前體細胞產生新的脂肪組織。也就是說，以前報道的組織工程方法構建的細胞－支架移植后所產生的新脂肪，是前脂肪細胞成熟形成的還是鄰近組織長入的爭論，天平向后者傾斜，這涉及脂肪組織工程的策略，可能誘導自身脂肪再生更重要。

四、組織構建和培養(yǎng)方法

使用的培養(yǎng)技術要能提供合適的條件促進前脂肪細胞－支架重組體的細胞黏附、生長和分化。脂肪組織工程的細胞接種是將前脂肪細胞懸液通過注射到支架或將支架浸泡在前脂肪細胞懸液里來完成的。培養(yǎng)方法分為靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)。如果提供動態(tài)培養(yǎng)條件，如使用旋轉瓶等生物反應器，可防止接種細胞沉降、改善細胞的空間分布、提高接種效率。脂肪是一個高代謝活性組織，對不充足的營養(yǎng)和氧尤其敏感，動態(tài)條件可促進這些物質向細胞的傳遞，可改善組織工程脂肪替代物的特性。

目前大多數(shù)組織工程脂肪替代物研究中，血管化依賴移植后的血管長入，使移植物中心部位的營養(yǎng)受限。在脂肪替代物中同時誘生血管的研究還未取得突破。脂肪間充質干細胞既能分泌促血管生成因子（如VEGF），又能在一定條件下分化為血管內皮細胞。因此，有人設想尋找合適的培養(yǎng)誘導條件或將脂肪生成細胞與能經適當刺激分化為血管細胞的干細胞共培養(yǎng)，可進一步重建出適合移植并長期維持容積和活力的血管化脂肪組織替代物。

另有學者在小鼠、大鼠、兔和豬動物實驗模型中重建了血管化的脂肪組織，其主要方法是：預先設計與所要修復缺損形狀一致的塑料小室，放入皮下，分離合適的血管使其穿過小室，再加入混有脂肪干細胞、bFGF等特殊生長或分化因子的可生物降解基質（如從Engelbreth－Holm－Swarm小鼠肉瘤中提取的富含基膜物質和生長因子的細胞外基質Matrigel和從肌肉提取的含膠原、層粘連蛋白和生長因子的Myogel），縫合皮膚。4～8周后，小室中將填滿帶血管的與設計形狀一致的脂肪組織。

五、組織工程脂肪替代物的評估方法

組織工程脂肪替代物的評估方法有HE觀察細胞構成；油紅O染色觀察脂質儲積；免疫組化檢查細胞外基質成分，如層粘連蛋白等；掃描電鏡觀察細胞和材料結合的情況；3－磷酸甘油脫氫酶（Glycerol－3－phosphate dehydrogenase，GPDH）活性測定；細胞內三酰甘油含量測定；脂肪分解率測定；RT－PCR檢測脂肪替代物中特征性的脂肪細胞基因，如PPAR－γ、Glut－4、瘦素（leptin）、β3－腎上腺素受體、層粘連蛋白－1β等的表達情況；ELISA法測定無血清培養(yǎng)基中的脂肪分泌因子，如瘦素、Adiponectin濃度等。通過這些指標，既可以了解材料對細胞的生物相容性，又可了解整個脂肪組織替代物的品質。

六、臨床應用策略和展望

組織工程處理皺紋和軟組織塌陷的策略是恢復導致異常輪廓的局部組織缺失。皺紋發(fā)生萎縮的解剖部位在真皮，逐漸累及表皮，因此，脂肪替代物的注射部位應在真皮和表皮之間；軟組織缺失最初累及皮下組織，最終可能累及從表皮到皮下的所有區(qū)域，并在真皮和肌肉之間形成黏著性斑塊，因此脂肪替代物注射或植入的部位應在肌肉和真皮之間。

另一個重建策略可能是注射黏附有前脂肪細胞和攜帶脂肪生成因子或血管生成因子的生物可降解聚合物微球或水凝膠。

最近，Melanie Vermette等提出基于細胞“自裝配技術”的脂肪組織工程策略（cellbased tissue engineering strategy）。理論基礎是將維生素C刺激人脂肪間充質干細胞產生的大量細胞外基質與誘導分化為脂肪細胞相結合。其方法是：在6孔板中以1．58× 105個／cm2接種人脂肪間充質干細胞，用含50mg／ml（250mmol／L）維生素C、10%胎牛血清的1∶1DMEM／F12培養(yǎng)基做常規(guī)培養(yǎng)，7d后用含250mmol／L維生素C、3%胎牛血清、100nmol／L胰島素、0．2nmol／L T3、1μmol／L地塞米松、0．25mmol／L IBMX和1μmol／L曲格列酮的1∶1DMEM／F12培養(yǎng)基成脂誘導3d，再換成含10%胎牛血清、100nmol／L胰島素、0．2nmol／L T3和1mmol／L地塞米松的1∶1DMEM／F12脂肪培養(yǎng)基培養(yǎng)。28d后將獲得的數(shù)個膜片疊在一起繼續(xù)培養(yǎng)7d，即可獲得一定厚度的黏著良好的自體脂肪替代物。目前該方法僅有體外研究報道。

總之，脂肪組織工程還處于起步階段，面臨許多的挑戰(zhàn)。一是目前的研究多在小型動物上應用，而臨床需要修復的軟組織缺損往往很大，其有效性還需要進一步探索。二是最科學的脂肪組織工程策略是細胞－支架重組體？是可注射復合體？是誘導脂肪原位再生？還是基于前脂肪細胞與大網膜碎片結合的脂肪再生？……這些還需要深入研究；三是如何使構建的脂肪組織長期保持活力，血管化的策略是需要充分考慮的問題。

（朱堂友　伍津津）

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