皮膚是與外界環(huán)境接觸的屏障，皮膚損傷是臨床的常見病、多發(fā)病，當由于外界損傷或疾病等因素造成嚴重皮膚缺損時，是可能致命的。

盡管組織工程化皮膚研究取得了突破性進展，在各種器官的組織工程中起帶頭作用，但皮膚替代物仍存在體外培養(yǎng)周期過長，皮膚血管化及表皮與真皮基質(zhì)相互沖突等諸多問題，使其臨床應(yīng)用受到一定限制。一種良好的人工皮膚替代物應(yīng)具備以下特征：①較好的組織相容性；②良好的血管化能力；③為新生膠原提供理想的纖維支架。組織工程皮膚作為皮膚替代物覆蓋傷口創(chuàng)面，能否有效促進血管形成是一個值得深入研究的重要問題。根據(jù)血管發(fā)生中內(nèi)皮細胞的來源不同，組織工程皮膚血管化可分為血管生成（vasculogenesis）和血管再生（angiogenesis）。前者指血管生成來源于外源性內(nèi)皮細胞及其前體細胞（即內(nèi)皮祖細胞），為初級血管網(wǎng)的發(fā)生和形成。后者是指血管的生長來源于已存在的內(nèi)皮細胞，是已存在的血管通過出芽等方式形成新的血管。在組織工程皮膚中是否加入內(nèi)皮細胞目前還存在爭論，一方面由于內(nèi)皮細胞存在較強的抗原性，移植后會增加免疫排斥反應(yīng)的可能，另一方面加入內(nèi)皮細胞后是否能形成有功能的毛細血管網(wǎng)還有待于進一步研究確證。最理想的方法是組織工程皮膚誘導(dǎo)受體自身內(nèi)皮細胞長入并構(gòu)建具有功能的毛細血管網(wǎng)，盡快為組織工程皮膚的存活提供營養(yǎng)。

一、接種種子細胞直接血管化

利用組織工程技術(shù)構(gòu)建皮膚采用的種子細胞為血管形成細胞，包括血管壁細胞和胚胎干細胞。

（一）血管壁細胞

多為血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和Fb，在體外進行培養(yǎng)、擴增后廣泛應(yīng)用于組織工程血管的研究。其來源主要有：①人體非必需的血管，如大隱靜脈、臍靜脈等，因臍靜脈取材方便，且對人體無明顯影響，目前已廣泛使用；②腹膜或皮下脂肪組織，如微血管內(nèi)皮細胞。Weinberg等以血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞等為種子細胞，首先在體外構(gòu)建出組織工程血管。也有研究者將人血管內(nèi)皮細胞接種在PLLA海綿或PLG支架中，移入裸鼠體內(nèi)成功分化出功能性血管并與裸鼠自身血管吻合，表達出CD31、CD34等血管內(nèi)皮標記。

（二）胚胎干細胞

理論上，胚胎干細胞具有發(fā)育全能性，能誘導(dǎo)分化成機體中所有類型的細胞。Lenvenberg等從人的胚胎干細胞成功誘導(dǎo)出內(nèi)皮細胞，并且在基質(zhì)膠中可以形成管樣結(jié)構(gòu)，在小鼠體內(nèi)也能形成功能性的毛細血管，為組織工程血管內(nèi)皮化提供新途徑。Shen等將鼠胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化成的內(nèi)皮細胞注入裸鼠皮下的支架上，也成功誘導(dǎo)出血管樣結(jié)構(gòu)。但由于胚胎干細胞的免疫原性及在倫理、道德、法律等方面的制約，其應(yīng)用也受到了限制。

（三）成體干細胞

根據(jù)成體干細胞的來源和分化方向可分為內(nèi)皮祖細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、造血干細胞、表皮干細胞、脂肪干細胞等。其與胚胎干細胞相比，自體移植可避免免疫排斥，導(dǎo)致細胞“永生化”而癌變的可能性小，也不存在倫理和道德上的問題。內(nèi)皮祖細胞又稱血管母細胞，是成熟內(nèi)皮細胞的前體。體外培養(yǎng)結(jié)果證實內(nèi)皮祖細胞可以分化成CD34＋的成熟內(nèi)皮細胞。間充質(zhì)干細胞有向血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞分化的多向分化潛能，多位于骨髓。國內(nèi)學(xué)者已在體外Matrigel上將骨髓間充質(zhì)干細胞成功誘導(dǎo)分化成Ⅷ因子陽性的血管內(nèi)皮細胞，并形成血管樣結(jié)構(gòu)。脂肪干細胞作為中胚層干細胞的來源，能夠分化為多種細胞。Cao等證明脂肪干細胞在適當條件下可誘導(dǎo)分化成成熟內(nèi)皮細胞，表達CD34和VE－鈣黏蛋白等，在體內(nèi)也能表達α－肌動蛋白，說明也具有形成血管平滑肌中層的可能。

二、細胞因子刺激血管化

多數(shù)促血管生成因子對血管生成有很強的刺激作用，一般不全身給藥，多利用局部緩釋系統(tǒng)控制各種因子釋放入血促進血管生成。一般是在接種內(nèi)皮細胞等種子細胞的同時，在支架內(nèi)復(fù)合促血管生成因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞等種子細胞向支架內(nèi)部遷移、增殖而形成毛細血管網(wǎng)。常用的細胞因子有VEGF、FGF、TGF－β、PDGF等。VEGF和FGF是直接誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞分裂、增殖和遷移的，而TGF－β、PDGF和血管生成素等是通過促進血管周細胞和平滑肌細胞的分裂、增殖和遷移來間接促血管生成的。生長因子與支架材料共混、凝膠法將生長因子固定在凝膠網(wǎng)絡(luò)中、微球包埋、超細纖維包埋和化學(xué)鍵合等是常用的控釋技術(shù)。實驗證明，用藻酸鈣微球作為人VEGF緩釋的載體，在大鼠皮下能顯著促進微球內(nèi)血管形成。上述其他生長因子也可明顯促進組織工程皮膚血管化。

三、轉(zhuǎn)基因技術(shù)促血管化

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將血管生成調(diào)控因子基因整合入靶細胞基因組，使其表達血管內(nèi)皮細胞的某些特征，達到促血管化目的。靶細胞可以是皮膚中的KC、Fb和內(nèi)皮細胞等，也可以是平滑肌細胞、內(nèi)皮祖細胞等種子細胞。如將VEGF165基因轉(zhuǎn)染至KC，可使其構(gòu)建的組織血管化時間縮短；將VEGF或PDGF基因轉(zhuǎn)染入Fb，再接種于支架上，可明顯改善缺血部位的缺血情況；將血管內(nèi)皮細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細胞移植，顯示可促進血管新生；利用轉(zhuǎn)基因端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶亞單位異位表達，顯著增加了平滑肌細胞的壽命，有利于血管生成。這些都顯示了基因修飾通過對靶細胞基因轉(zhuǎn)染促血管化的功效，但目前尚需進一步研究如何確定高效穩(wěn)定的靶基因和傳遞系統(tǒng)。

四、支架材料對組織工程皮膚血管化的影響

組織工程皮膚的血管化要求在支架內(nèi)形成有功能的血管網(wǎng)，因此支架材料要與內(nèi)皮細胞等種子細胞有很好的生物相容性，有良好的生物降解性、可塑性和一定的機械強度，并有合適的孔隙率和孔隙大小，這樣才能促進毛細血管長入。血管支架材料根據(jù)來源和相容性大體可分為不可降解材料和可降解材料兩大類。

（一）不可降解材料

主要包括滌綸和聚四氟乙烯等，這些材料一般用于較大血管的支架，并不適合做皮膚毛細血管這樣小血管的支架，而且此類材料塑形性差，無正常血管收縮性，易感染，而且支架材料不能降解也并非真正意義的組織工程理念，已逐漸被淘汰。

（二）可降解的高分子合成材料

主要包括聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）及兩者的混合物聚乳酸羥基乙酸（PLGA）、聚乙醇酸（PLLA）、聚羥基丁酸（PHB）和聚氨酯（Pu）等。這些材料有良好的相容性和可塑性，可在體內(nèi)完全降解，減少異物反應(yīng)，但其缺乏細胞外基質(zhì)中的生物信號和功能基團，與種子細胞黏附性較差。

（三）可降解的天然生物材料

包括葡聚糖、明膠、殼多糖、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、彈性蛋白、多聚氨基酸等。此類材料本身來源于生物機體，包含許多生物信息，有良好的細胞親和力，能夠提供細胞生長、繁殖、分化所需的信號，在細胞的黏附和維持方面具有優(yōu)勢。其在生物相容性、順應(yīng)性和免疫排斥等方面均優(yōu)于合成材料。

本實驗室研制的復(fù)發(fā)殼多糖組織工程皮膚就是以鼠尾膠原（或牛膠原）、殼多糖、硫酸軟骨素和葡聚糖等天然生物材料作為支架的。硫酸軟骨素是存在于ECM中的一種蛋白多糖，不僅對細胞具有支持和保護作用，同時影響細胞的分化和增殖。硫酸軟骨素有促進Fb增殖的作用，硫酸軟骨素B通過控制多種生長因子對Fb產(chǎn)生作用，用軟骨素酶B降解硫酸軟骨素B后可以顯著降低Fb的增殖，且這種抑制作用不能通過再增加硫酸軟骨素B而改善。透明質(zhì)酸是一種高分子量糖胺聚糖，它可以促進Fb的遷移和增生，抑制其分化，還能增強各種生長因子的活性。殼多糖是一種天然聚陽離子生物多糖，因其作為細胞外基質(zhì)具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，是相對于膠原更理想的生物支架。殼多糖能加強VEGF的分泌，其作用可能來源于兩個方面：①通過刺激Fb增殖來增加VEGF的分泌。其機制可能有：殼多糖在體內(nèi)降解生成的寡糖可以刺激各種細胞的生長，促進成纖維細胞增生；殼多糖也通過增強各種生長因子（包括PDGF在內(nèi)）的表達而促進Fb增生；殼多糖可與肝素或生長因子結(jié)合，并穩(wěn)定和活化這些物質(zhì)，促進Fb增生；殼多糖也可能通過形成聚合電解質(zhì)復(fù)合物促進Fb增生。②通過上述ECM作用促進VEGF的分泌。采用殼多糖、透明質(zhì)酸、6－硫酸軟骨素和鼠尾膠原（或牛膠原）等共同構(gòu)成支架材料，除了更有利于種子細胞生長外，也使種子細胞在復(fù)方殼多糖支架中三維培養(yǎng)時能沉積大量的細胞外基質(zhì)，并與這些基質(zhì)相互作用，促進VEGF等促血管生成因子的分泌。

五、組織工程皮膚血管化的研究模型

組織工程皮膚血管化的研究模型可分為體外和體內(nèi)兩種。體外實驗可以檢測支架與內(nèi)皮細胞的黏附、增殖和遷移、趨化作用及抑制凋亡、材料的細胞毒、血管化效應(yīng)和各種生長因子的調(diào)節(jié)作用，體內(nèi)最簡便實用的是雞胚尿囊膜實驗，更高等的則是在完整動物體內(nèi)進行。這些研究模型的檢測手段涵蓋了血管生成甚至血管再生。

（一）體內(nèi)模型

1．雞胚尿囊膜中刺激血管生成 將10日齡雞胚在37℃下孵育，雞蛋經(jīng)對光檢查后確定和標記一個無大血管的區(qū)域作為靶區(qū)，在蛋殼上鉆孔，一個在氣囊正上方，一個在靶區(qū)上方。對第一個孔進行抽吸，使尿囊絨膜（CAM）從標記區(qū)脫落。將靶區(qū)的部分蛋殼去掉，將一直徑為4mm的環(huán)形樣本（組織工程皮膚）放于尿囊膜附近。把孔封閉起來后，將雞蛋置于37℃培養(yǎng)72h觀察血管生長。然后，把已處理過的尿囊膜取出、拍照并固定在甲醇中。計數(shù)樣本區(qū)域毛細血管分支點，活檢的組織樣本固定在甲醇中，切片采用Masson三色染色法。

與對照組比較，三維的含F(xiàn)b的組織在CAM中誘導(dǎo)血管生成的范圍應(yīng)更大，具有表現(xiàn)出通透性增高的現(xiàn)象，毛細血管網(wǎng)也清晰可見。這種類型的毛細血管為VEGF誘導(dǎo)的血管生成的一種表現(xiàn)，它不同于用bFGF所誘導(dǎo)的血管，后者所生成的血管直徑較大，而通透性不增高或僅輕度增高。

2．大鼠主動脈環(huán)實驗 把從1～2個月大的Sprague－Dawley雄性大鼠中獲取的胸主動脈轉(zhuǎn)移到不含血清的MCDB131培養(yǎng)基或M199培養(yǎng)基中，小心地去除主動脈周的纖維脂肪組織，漂洗主動脈8～10次并切成1mm長的片段。在鉆孔的1．5%瓊脂糖凝膠中加滿具有凝固血液能力的血纖維蛋白原溶液，將主動脈環(huán)放入孔中心。凝血后，加滿不含血清的MCD131培養(yǎng)基或M199培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃條件下孵育，每天換液一次，新生成的微血管分別在第3天、第7天、第14天計數(shù)。當主動脈環(huán)與活性成纖維細胞性工程化組織共培養(yǎng)時，微血管生成的數(shù)量會明顯增加。

（二）體外模型

1．刺激內(nèi)皮細胞增殖實驗 內(nèi)皮細胞增殖是血管生成的關(guān)鍵步驟。成纖維細胞性工程化組織可通過［3 H］胸腺嘧啶摻入法來測定其刺激能力。此實驗還可用來檢測多種生長因子和濃縮的條件培養(yǎng)基對人血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）增殖的影響。HUVEC傳代后用培養(yǎng)液重懸，細胞濃度為2．5×104個／ml。用明膠溶液等黏附因子溶液來預(yù)處理24孔板，然后每孔加入1ml細胞懸液，待細胞貼壁后，培養(yǎng)基改為內(nèi)皮細胞無血清培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基添加了Fb培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基，（條件培養(yǎng)基來自從單層或三維成纖維細胞培養(yǎng)物）。第2天時，更換為新鮮的含有1μCi／ml［3 H］胸腺嘧啶的無血清培養(yǎng)基。第3天時，吸干培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）漂洗3遍，加入胰蛋白酶消化細胞后，將消化液和1ml PBS洗滌液吸入閃爍計數(shù)杯中，Beckman LS6500閃爍計數(shù)儀測定放射性強度。

用三維成纖維細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基配制的條件培養(yǎng)基會刺激［3 H］胸腺嘧啶摻入到內(nèi)皮細胞中，其增生效果呈劑量依賴性。

2．刺激內(nèi)皮細胞的化學(xué)動力學(xué)實驗可通過2種測定法來檢測。第一種是化學(xué)動力學(xué)測定法，此法可測定不受任何方向限制的細胞運動，第二種是測定細胞向刺激源的遷移。這種方法是測定Cytodex－2磁珠上生長的內(nèi)皮細胞從磁珠上分離下來再與培養(yǎng)板黏附的方法。將培養(yǎng)板上的細胞進行染色并計數(shù)。這些細胞與成纖維細胞性工程化組織共培養(yǎng)后，從Cytodex－2磁珠向培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移的細胞數(shù)會顯著增加。

3．刺激內(nèi)皮細胞化學(xué)趨化性 將聚碳酸酯膜濾紙浸泡在醋酸中過夜，用水清洗3次，時間持續(xù)1h，在0．01%小牛皮膚Ⅲ型明膠中孵育12～16h，然后空氣干燥，HUVECs消化分離和重懸于培養(yǎng)基中，終濃度為1．0× 105個／ml。博伊登室的裝配過程如下：底孔加樣本或標準液每孔30μl，明膠包被的膜置于其上，然后將50μl細胞懸液加到上述孔中。博伊登室在37℃下孵育3h，然后小心將膜從博伊登室取出，把接觸細胞的一面在PBS中漂洗，并用刮片刮除未遷移的細胞，膜行Wright吉姆薩染色，細胞計數(shù)，或染色強度通過對照標準曲線查出相應(yīng)值，此曲線由濃度為20ng／ml、10ng／ml、5ng／ml、0ng／ml的純化VEGF繪制出來。

由成纖維細胞性組織工程化產(chǎn)品的培養(yǎng)基配制的條件培養(yǎng)基可刺激細胞遷移，并呈劑量依賴性。與陽性對照組相比，三維的成纖維細胞組織培養(yǎng)基刺激HUVEC遷移作用更明顯。

4．誘導(dǎo)整合素αvβ3的表達 已經(jīng)證明，整合素αvβ3在血管生成過程中起著重要作用，而其對應(yīng)的中和抗體能夠阻斷血管的形成。整合素αvβ3的表達為VEGF所誘導(dǎo)，而且認為它在內(nèi)皮細胞遷移過程中起著關(guān)鍵性作用。

在FACStar上使用流式細胞計數(shù)可以測定整合素和細胞表面受體的存在。先用胰酶消化HUVECs，并將細胞重懸至濃度為106個／ml。取250～500μl細胞懸液用Hank平衡鹽液（HBSS）漂洗3遍，最后重懸于含10%胎牛血清（FBS）的HBSS中，加入用10%FBS的HBSS稀釋至1μg／ml的一抗，孵育30min，用HBSS漂洗3遍后，在細胞中加入用10%FBS的HBSS稀釋至1μg／ml的二抗，孵育30min，再用HBSS漂洗3遍后，最后固定在200μl 10%甲醛溶液中，使其細胞濃度為106個／ml。

在正常培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)的HUVECs表面大量表達出整合素αvβ3，然而，在以Fb為基礎(chǔ)的組織工程化產(chǎn)品條件培養(yǎng)基使該整合素的表達顯著增加。

5．血管生成生長因子的表達 生長因子的表達通過兩種方式進行檢測，一種是利用PCR方法測定mRNA的水平，一種是利用ELISA來測定游離蛋白的量。

利用ABI TaqMan方法通過定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（定量RT－PCR）對特異mRNAs進行檢測。利用一種RNA快速純化試劑盒從細胞中提取所有RNA。然后使用引物對RNA進行反轉(zhuǎn)錄。利用每個反應(yīng)在40～4 000 000內(nèi)的5個數(shù)量級的拷貝數(shù)，對含有200ng RNA的樣本cDNA的擴增情況進行實時監(jiān)測，并就與質(zhì)粒源性特異mRNA標準序列樣本進行比較。在反轉(zhuǎn)錄的純化和效率方面，將血小板源性生長因子（PDGF）B鏈、VEGF或TGF－β1的mRNA序列加入到RNA分離物中，然后用TaqMan方法測量其產(chǎn)量。對照mRNA序列是將含相應(yīng)序列的質(zhì)粒通過tRNA聚合酶轉(zhuǎn)錄得到的。以甘油醛－3－磷酸脫氫酶作為對照校正。

（周　凌）

參 考 文 獻

［1］Shalaby F，Rossant J，Yamaguchi TP，et al．Failure of blood－island formation and vasculogenesis in FLK－1－deficient mice．Nature，1995，376：62

［2］Sato TN，Tozawa Y，Deutsch U，et al．Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tie－1 and Tie－2in blood vessel formation．Nature，1995，376：70

［3］Maisonpierre PC，Suri C，Jones PF，et al．Angiopoietin－2，a natural antagonist for Tie 2 that disrupts in vivo angiogenesis．Science，1997，277：55

［4］Folkman J，D＇Amore PA．Blood vessel formation：what is the molecular basis？Cell，1996，87：1153

［5］Varner JA，Brooks PC，Cheresh DA．The integrin alpha V beta 3：angiogenesis and apoptosis．Cell Adhes Commun，1995，3：367

［6］Hanahan D，F(xiàn)olkman J．Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis．Cell，1996，86：353

［7］Plow EF，Herren T，Redlitz A，et al．The cell biology of the plasminogen system．FAESB J，1995，9：939

［8］楊志明，等，譯．組織工程原理（第2版）．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：848－852