用管碟法測(cè)定抗生素的效價(jià)，是國(guó)內(nèi)外常用的方法，也是生物測(cè)定中最準(zhǔn)確、最簡(jiǎn)便的方法。但是由于其原理是以擴(kuò)散為基礎(chǔ)的，所以只要是能影響擴(kuò)散的因素，就能影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。從動(dòng)力學(xué)方程式可以看出抑菌圈的大小受擴(kuò)散系數(shù)、擴(kuò)散時(shí)間、抗生素的總量、培養(yǎng)液的厚度及最低抑菌濃度等因素的影響。在檢測(cè)中應(yīng)控制這些因素的影響。另一方面，本檢測(cè)方法又是以抗生素濃度與抑菌圈直徑呈直線關(guān)系的平行線原理而設(shè)計(jì)的，因此對(duì)影響直線的斜率、截距及直線平行性的諸因素也必須加以控制，方可保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

（一）直線斜率的控制

斜率小，即抗生素濃度差異小，而抑菌圈的直徑差異大，靈敏度準(zhǔn)確性高，由動(dòng)力學(xué)公式可知：1／9．21DT為直線斜率，故斜率決定于D、T。如D、T不變時(shí)，則斜率恒定，即各直線互為平行。如擴(kuò)散快，即D值大，則斜率就?。蝗缭囼?yàn)菌生長(zhǎng)慢，時(shí)間長(zhǎng)，T值就大，則斜率亦小。斜率小生物反應(yīng)靈敏度高。某些試驗(yàn)菌生長(zhǎng)迅速，如蠟樣芽孢桿菌，可通過(guò)控制培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分或降低其pH，或降低溫度等措施促其生長(zhǎng)延緩。如使備妥菌層雙碟預(yù)先冷卻，再滴加抗生素溶液；或滴加抗生素溶液后，先在室溫預(yù)擴(kuò)散，再置溫箱中培養(yǎng)等，這些都可使T或D值增大，使斜率變小。當(dāng)擴(kuò)散系數(shù)D不變時(shí)，T值變小，即試驗(yàn)菌生長(zhǎng)速度快，斜率增大，這樣靈敏度降低，重現(xiàn)性也差。因此采用快速測(cè)定效價(jià)時(shí)，其誤差＞一般常規(guī)測(cè)定法。在一般試驗(yàn)條件下擴(kuò)散系數(shù)D值變化不大，但如培養(yǎng)液中鹽量、瓊脂量、加菌量、溫度等變化均會(huì)影響D值改變，從而影響斜率。

（二）直線截距的控制

直線截距決定于C、D、T、H諸因素，其中D、T值一般相當(dāng)穩(wěn)定，所以，C、H值是決定截距的主要因素。如將培養(yǎng)液厚度H減小，截距也隨之減小，抑菌圈增大。據(jù)此可設(shè)計(jì)薄層培養(yǎng)液，可大大提高檢驗(yàn)的靈敏度。此法可用于食品或血液中含微量抗生素的測(cè)定。同時(shí)試驗(yàn)菌敏感度C對(duì)截距影響較大，而C常受接種量、培養(yǎng)液成分、pH及溫度影響而變化，試驗(yàn)中亦須注意。

（三）抑菌圈大小的控制

抑菌圈的大小受L、H、C、D、T及A等諸因素的影響。抗生素總量M＝CV＝CAL（A為管底面積、H為高度、V為管內(nèi)體積、C為抗生素濃度）的影響：從（1）式看r2＝4DT［lnM－lnC－ln（4πDTH）］，可見(jiàn)抗生素濃度是影響抑菌圈大小的，若C不變，則r2隨V而變化，那么L或A均影響抑菌圈大小。因此抗生素濃度應(yīng)準(zhǔn)確，包括稱量、稀釋均應(yīng)準(zhǔn)確，稀釋用的儀器、容器均應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)要注意小鋼管的規(guī)格應(yīng)一致，內(nèi)外壁光潔，兩端平齊光滑，壁厚薄均勻一致，切面應(yīng)圓整。適時(shí)恰當(dāng)?shù)胤胖眯′摴?，防止放置小鋼管時(shí)重力不一致；加入小鋼管內(nèi)的藥液要與小鋼管內(nèi)的高度齊平。雙碟、刻度吸管等要防止污染和殘留微量抗生素等。

培養(yǎng)液的厚度H、試驗(yàn)菌敏感度C、擴(kuò)散時(shí)間T及擴(kuò)散系數(shù)D的影響：H增大，r縮?。籆減小，r增大。C常受加菌量及其對(duì)抗生素耐藥性等因素的影響而有所改變，從而影響r大小。T受細(xì)菌生長(zhǎng)快慢的影響而引起r改變。D擴(kuò)散快慢亦可使r改變。因此應(yīng)注意選用敏感性的試驗(yàn)菌并保持其不變異，特別要防止染菌，制備菌層時(shí)含菌濃度要適宜。向小鋼管內(nèi)滴加標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液時(shí)要交叉進(jìn)行，以免偏向。培養(yǎng)箱溫度要恒定，否則均會(huì)影響T值。滴定操作臺(tái)要水平，雙碟底要平坦，底層和菌層一定要鋪平，尤其是菌層，否則影響H值。培養(yǎng)液中瓊脂量、鹽類等都影響D值，這些因素的變化又影響r的大小。

（四）劑量反應(yīng)直線范圍控制

直線范圍在下列情況下會(huì)縮短：管徑小、裝量少；濃度低；因培養(yǎng)液或試驗(yàn)菌吸附或破壞抗生素等因素使小鋼管中抗生素量下降，導(dǎo)致直線范圍縮短，常使呈弧形。為此可用調(diào)整緩沖液的pH，使抗生素穩(wěn)定；調(diào)整培養(yǎng)液pH；調(diào)整培養(yǎng)液的處方及除去雜質(zhì)；選用更為敏感的試驗(yàn)菌加以控制。同時(shí)在抑菌圈形成過(guò)程中，溫度發(fā)生變化，影響T值，使斜率變化，直線范圍亦可因之縮短。

（五）抑菌圈圓整及清晰度的控制

抑菌圈常有破裂不圓，甚至無(wú)圈現(xiàn)象。這些情況的產(chǎn)生主要是由于向小鋼管加抗生素溶液時(shí)有濺出或漏出；有時(shí)也可能因雙碟或小鋼管殘留或污染有抗生素而造成的。如果污染雜菌或因菌層培養(yǎng)液溫度過(guò)高，試驗(yàn)菌被燙死，均會(huì)使抑菌圈不圓整或破裂。有的抗生素如新霉素A、鏈霉素等會(huì)因抗生素中含的鹽類濃度太高或pH太低而形成卵形等形態(tài)，甚至無(wú)圈。

在某些情況下出現(xiàn)抑菌圈邊緣模糊、類似鋸齒狀或呈雙圈等現(xiàn)象，主要由下列因素所引起：

（1）當(dāng)試驗(yàn)菌培養(yǎng)物不純，含有一同敏感度的幾種菌株，如菌種中含耐藥性菌，使C含有C′、C″、C等差異，類似鋸齒狀或呈雙圈等現(xiàn)象，主要由下列因素同敏感度的幾種菌株，如菌種中雜有耐藥性菌，致使擴(kuò)散系數(shù)紊亂。其次菌種中有不同生長(zhǎng)時(shí)間的菌體，以致有不同的T值，這些都能使抑菌圈邊緣不清晰。

（2）抗生素的培養(yǎng)液內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)不一如混有幾種類型的抗生素、抗生素受緩沖液或受培養(yǎng)液內(nèi)的雜質(zhì)影響或使其形成某種化合物，致使抗生素濃度總量發(fā)生變化。因此，對(duì)培養(yǎng)液的原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等的選用極為重要。這些都可影響抑菌圈的大小和清晰度。

（3）小鋼管內(nèi)的抗生素濃度不斷下降；當(dāng)試驗(yàn)菌能吸附或破壞抗生素時(shí)，就更為嚴(yán)重，此時(shí)可出現(xiàn)雙圈現(xiàn)象。

（4）不適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，由于某些抗生素的抑菌圈邊緣的菌群只是被抑制，當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)限后，菌量增加，使抗生素敏感度降低，抑菌圈邊緣菌群繼續(xù)繁殖，導(dǎo)致抑菌圈變小或邊緣模糊不整齊，如測(cè)定制真菌素時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，其抑菌圈邊緣就不清晰或不整齊。要控制培養(yǎng)時(shí)限，使抗生素在培養(yǎng)液內(nèi)的濃度，恰能抑制試驗(yàn)菌，而在抑菌圈邊緣的濃度能刺激試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)，就能形成清晰的抑菌圈。

此外，對(duì)抗生素標(biāo)準(zhǔn)品和供試品同質(zhì)的要求至為重要。因?yàn)樾r(jià)測(cè)定設(shè)計(jì)假定二者劑量反應(yīng)直線是相互平行的，如不平行或斜率不等，那么計(jì)算結(jié)果就必然發(fā)生較大誤差。不平行性除操作影響外，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)品中或供試品中若有其他抗菌性物質(zhì)或影響抗菌活性的物質(zhì)（加強(qiáng)或拮抗），均可使二者劑量反應(yīng)直線不平行，對(duì)此必須注意。如供試品四環(huán)素制劑中含有維生素C時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)品中也應(yīng)加入相應(yīng)量的維生素C，以保持標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的同質(zhì)性，這樣檢驗(yàn)結(jié)果才是可行的，也才能準(zhǔn)確。

（六）操作技術(shù)的注意事項(xiàng)

（1）由于抗生素效價(jià)測(cè)定管碟法是微量的微生物分析法，故稱量除應(yīng)滿足用容量及儀器進(jìn)行定量分析的一般要求外，還應(yīng)注意效價(jià)測(cè)定試驗(yàn)室內(nèi)防止抗生素污染。效價(jià)測(cè)定滴加鋼管的操作室內(nèi)，地面、水平操作臺(tái)、鋼管放置器、鋼管，以及各種玻璃器皿等，都要避免被抗生素污染。即使有微量抗生素的污染，往往使試驗(yàn)結(jié)果混亂。在配制培養(yǎng)液或緩沖液時(shí)，亦應(yīng)嚴(yán)防被抗生素污染。

（2）操作次序安排上的誤差：在一劑量法制備校正曲線時(shí)，雙碟數(shù)量較多，滴加抗生素溶液至鋼管的時(shí)間，各個(gè)雙碟的時(shí)間應(yīng)基本一致。如滴加8組稀釋度雙碟，可從中心濃度組開(kāi)始向高、低二端交叉滴加。如稀釋度為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7及C8，滴加次序可C4、C5、C3、C6、C2、C7、C1及C8。這樣，可減小各組間抗生素?cái)U(kuò)散時(shí)間及試驗(yàn)菌生長(zhǎng)時(shí)間的差異。尤以枯草桿菌在室溫較高時(shí)，這種影響更為明顯。此外，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱量，應(yīng)在相近的時(shí)間內(nèi)稱取，稀釋后的溶液盡量在相同的條件下放置，并使放置的時(shí)間也相似，以減少誤差。

滴加雙碟小鋼管的次序所致的誤差，受操作者的熟練程度的影響，而且在方法設(shè)計(jì)上也是無(wú)法抵消的。因此，要求滴加迅速，如一組三個(gè)雙碟18個(gè)小鋼管的滴加時(shí)間，控制在1min以內(nèi)較好。在操作很多檢品時(shí)，以分批操作為好，切勿同時(shí)放置幾排雙碟先滴好標(biāo)準(zhǔn)品溶液后滴加各批供試品溶液，這樣使標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的擴(kuò)散時(shí)間和細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)間帶來(lái)差異，引致誤差。

（3）測(cè)量抑菌圈應(yīng)避免誤差：測(cè)量抑菌圈是本法取得試驗(yàn)結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，目前多已采用抑菌圈面積測(cè)量?jī)x，此測(cè)量?jī)x克服了使用游標(biāo)卡尺容易產(chǎn)生的主觀誤差。