（一）材料和方法

1．材料

（1）菌株和培養(yǎng)：異煙肼耐藥MTB，經(jīng)平板傳代表明遺傳穩(wěn)定。細(xì)菌在Middlebrook　7H9（Difco）添加OADC（0．5%牛血清白蛋白，0．2%葡萄糖，0．06%油酸甘油酯，140mmol／L NaCl）的液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。200ml Middlebrook　7H9培養(yǎng)基內(nèi)接種總數(shù)為2×108的耐藥結(jié)核分枝桿菌，37℃培養(yǎng)6～8d，至細(xì)菌密度為1×108／ml～2×108／ml或光密度（OD600）為0．8～1．0。

（2）主要儀器：PRTEAN IEF Cell等電聚焦電泳儀，PROTEAN Xi Cell垂直板電泳儀，Molecular ImageFx凝膠圖像掃描儀，PDQuest　6．0圖像分析軟件，均為美國Bio－Rad公司產(chǎn)品；U3000分光光度計(jì)為HITACHI公司產(chǎn)品，質(zhì)譜分析系統(tǒng)為美國AppliedBiosystems公司的ABI　4700基質(zhì)輔助激光解吸／電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI TOFMS）。

2．藥物處理　將貓爪草75%乙醇浸提物濃縮后，每毫升相當(dāng)于5g生藥，處理終濃度為每毫升相當(dāng)于1g生藥濃度。將濃縮提取物加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的結(jié)核菌培養(yǎng)基中，處理30min后進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)電泳和凋亡等分析。

3．細(xì)胞蛋白樣品的制備　4　000r／min，4℃離心15min，沉淀細(xì)菌，用pH　7．4的PBS緩沖液洗滌沉淀細(xì)菌2次。用1ml MilliQ水（含1mmol／LPMSF，10mmol／LEDTA）溶解。超聲破碎裂解細(xì)菌15min，振幅70%，超聲1min，停10s。緩慢加入尿素到超聲裂解物至終濃度9mol／L，二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度為70mmol／L。分別加入Bio－lyte和OG至終濃度為2%。樣品置于室溫中30min，間隔振蕩。10　000r／min，20℃離心30min，收集上清液，－70℃凍存。Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

4．雙向凝膠電泳

（1）第一向——固定pH梯度等電聚焦凝膠電泳：采用低電壓膠內(nèi)泡脹法。將30μl細(xì)胞蛋白樣品360μl上樣緩沖液（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4%CHAPS，65mmol／L DTT，2g／L Bio－lyte，0．001%溴酚藍(lán)）混合，加入樣品水化盤中，放入17cm，pH　4～7的固定pH梯度膠條，加蓋1～2ml液狀石蠟。水化和等電聚焦按設(shè)置的程序進(jìn)行，即水化50V12h，除鹽250V1h，1　000V1．5h，升壓8　000V5h，聚焦8　000V，60　000Vh。等電聚焦后的固定pH梯度膠條在平衡緩沖液（6mol／L尿素，2%SDS，1．5mol／L Tris·HCl pH　8．8，20%甘油）中平衡30min，轉(zhuǎn)移至12%SDS聚丙烯酰胺凝膠的上端。

（2）第二向——SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）：以每一膠條10mA恒流電泳30min，再加大電流至30mA直至溴酚藍(lán)達(dá)到膠的底線。染色采用高靈敏度的銀氨染色。

5．凝膠圖像的分析　凝膠用Molecular Image Fx凝膠圖像掃描儀掃描，配比分析采用PDQuest　6．0軟件完成。比較不同披次處理后凝膠的電泳質(zhì)量和重復(fù)性，選取效果最好的來進(jìn)行比較。與對(duì)照組相比，貓爪草作用后結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)凝膠圖像上所有發(fā)生了顯著性變化（P＜0．05）的蛋白質(zhì)點(diǎn)都被篩選出來。篩選出來的所有蛋白質(zhì)點(diǎn)都經(jīng)過人工的檢驗(yàn)，以確保不是實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的假相。

6．肽指紋圖譜分析　樣品切下放入樣品管中，用25mmol／L碳酸氫銨溶液配制的50%乙腈溶液100μl脫色，真空冷凍干燥后加入0．01g／L胰蛋白酶10μl，4℃放置30min，37℃保溫18h，再加入5%三氟乙酸溶液100μl，40℃作用1h，吸出上清液，加2．5%三氟乙酸溶液和50%乙腈溶液各100μl，30℃保溫1h，吸出上清液，合并2次上清液，冷凍干燥。用10μl　0．5%三氟乙酸溶解冷凍干燥肽段，取1μl做肽指紋圖譜分析。

7．蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索　根據(jù)肽指紋圖譜，采用Ms－Fit和Mscot搜索程序搜索NCBI的冗余數(shù)據(jù)庫（redundant database）。搜索限定條件為細(xì)菌，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為10～100kDa，等電點(diǎn)pI值為4～7，胰蛋白酶消化。

（二）結(jié)果

1．藥物作用前后結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株的2－DE圖譜比較分析　用PDQuest軟件對(duì)藥物作用前后的兩張2－DE圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩者的差異斑點(diǎn)有22個(gè)，蛋白質(zhì)分子量均處于10～100kD，pI值分布于4～7。切割其中差異明顯的3個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行肽指紋分析。

2．MALDI－TOF－MS分析及數(shù)據(jù)庫檢索　切割2－DE凝膠上藥物作用后表達(dá)明顯下調(diào)的3個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，胰蛋白酶消化后，進(jìn)行MALDI TOFMS檢測(cè)，得到肽質(zhì)量指紋圖譜。通過數(shù)據(jù)庫搜索，結(jié)合2－DE圖譜上相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、pI值，確定這3個(gè)蛋白質(zhì)分別為：Spot　1為硫代硫酸基轉(zhuǎn)移酶（thiosulfate sulfurtransferase）；Spot　2為延長因子Ts（elongation factor EF－Ts）；Spot　3為熱休克蛋白X（heat shock protein X），結(jié)果見表4－6。

表4－6　2－DE分離鑒定的結(jié)核分枝桿菌在藥物處理后表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)

（1）質(zhì)量分析Ms－Fit搜索后，由氨基酸序列的多肽片段之間的相似匹配度進(jìn)行評(píng)分，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)得分＞70，這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是有顯著性（P＜0．05）

研究以臨床分離、遺傳穩(wěn)定的中國菌株為對(duì)象，在蛋白質(zhì)組水平探索藥物的影響，有助于進(jìn)一步深入研究貓爪草抗結(jié)核菌的機(jī)制。硫代硫酸基轉(zhuǎn)移酶是類似硫氰酸生成酶（rhodanese）廣泛存在于各種生物體中，在哺乳動(dòng)物中，該酶與半胱氨酸、甲硫氨酸的厭氧代謝，氰化物的解毒，轉(zhuǎn)錄后tRNA的硫化以及免疫增強(qiáng)都相關(guān)。而結(jié)核分枝桿菌基因組共編碼了4種硫代硫酸基轉(zhuǎn)移酶（CysA2［Rv0815c］，CysA3［Rv3117］，SseA［Rv3283］，SseB［Rv2291］），說明這類蛋白對(duì)分枝桿菌非常重要。貓爪草作用后MTB硫代硫酸基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)，說明它可能通過對(duì)該酶的抑制，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的氨基酸代謝，轉(zhuǎn)錄水平，氰化物的解毒以及硫和鐵轉(zhuǎn)移等方面產(chǎn)生影響，這可能是貓爪草提取物治療結(jié)核病的一種機(jī)制。

hspX（或稱為α－晶體蛋白同族體）是結(jié)核分枝桿菌中的一種16kDa的蛋白，具有分子伴侶和轉(zhuǎn)錄因子特性，由hspX基因（Rv2031c）編碼，是小型熱休克蛋白家族中的一員。它在結(jié)核分枝桿菌由對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)為穩(wěn)定期時(shí)表達(dá)上調(diào)，且為穩(wěn)定期豐度最高的蛋白之一。結(jié)核分枝桿菌的hspX突變株在體外生長沒有變化，但在骨髓巨噬細(xì)胞和THP－1細(xì)胞中的生長明顯受損。另外在巨噬細(xì)胞中生長的BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的hspX顯著上調(diào)。穩(wěn)定期被認(rèn)為是MTB持續(xù)感染時(shí)的狀態(tài)。因此hspX對(duì)結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染作用至關(guān)重大。本研究中貓爪草作用后hspX顯著下調(diào)，說明該藥物可能通過減少結(jié)核分枝桿菌hspX的表達(dá)，影響菌的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，影響細(xì)菌的正常代謝。

一般認(rèn)為，中藥治療包括結(jié)核病在內(nèi)的多種疾病的優(yōu)勢(shì)在于它的多靶點(diǎn)作用。本研究的結(jié)果可推測(cè)部分這種效應(yīng)。貓爪草作用導(dǎo)致表達(dá)明顯下調(diào)的3種蛋白也相互影響：延長因子與翻譯有關(guān)，其表達(dá)下調(diào)必定影響其他蛋白的合成；熱休克蛋白是廣泛存在的分子伴侶，與蛋白質(zhì)的合成、折疊、運(yùn)輸和分泌有關(guān)，多種蛋白質(zhì)都以其作為伴侶；硫代硫酸基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)下調(diào)使氨基酸代謝和解毒作用受影響，但是對(duì)其他蛋白質(zhì)的影響如何有待研究。

本研究采用雙向電泳（2－DE）技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸／電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)MALDI－TOF－MS），應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，來研究貓爪草提取物對(duì)臨床分離的結(jié)核分枝桿菌作用前后的蛋白表達(dá)差異，比較分析了貓爪草提取物作用前后結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的全細(xì)胞蛋白表達(dá)差異。結(jié)果表明，貓爪草對(duì)結(jié)核分枝桿菌有明顯抑制作用，這種作用可能與硫代謝和其他持續(xù)感染有關(guān)的蛋白質(zhì)相關(guān)。對(duì)這些蛋白質(zhì)與貓爪草有效成分的相互作用研究將有助于闡明是否確為靶標(biāo)，并將為基于靶標(biāo)的抗結(jié)核病藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。同時(shí)，蛋白質(zhì)組技術(shù)是研究藥物對(duì)致病菌的作用和發(fā)現(xiàn)新的靶標(biāo)的非常有前景的方法。

本研究發(fā)現(xiàn)22個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)具有明顯差異，對(duì)其中3個(gè)表達(dá)明顯下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸／電離飛行時(shí)間MALDI－TOF－MS），質(zhì)譜分析，獲得了肽質(zhì)量指紋圖譜。數(shù)據(jù)庫檢索分析確定這3個(gè)點(diǎn)代表的蛋白質(zhì)分別為硫代硫酸基轉(zhuǎn)移酶，延長因子Ts和熱休克蛋白X，分別參與厭氧硫代謝、蛋白質(zhì)翻譯和蛋白質(zhì)折疊分泌、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程。這有助于深入研究貓爪草對(duì)結(jié)核分枝桿菌的作用機(jī)制，也為發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核病治療藥物靶標(biāo)提供了線索。