第十九章　結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病機(jī)制

結(jié)核分枝桿菌在演化過程中獲得與人體共同生存的能力。在20世紀(jì)中，人類已發(fā)展了有利于其本身方面的有效措施，例如社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件、適當(dāng)?shù)木邮覘l件和營(yíng)養(yǎng)的改善，疾病發(fā)生后的有效診斷和治療等。但是斗爭(zhēng)絕非僅限于某一方面。結(jié)核菌仍力圖減弱人體的防御能力。其他疾病，如人類免疫缺陷病毒（HIV）、感染流行上的變化將使平衡趨向于有利于細(xì)菌這一方面；而耐藥性的逐漸發(fā)展又可進(jìn)一步降低宿主的防御力。對(duì)于這一復(fù)雜相互作用有關(guān)機(jī)制的了解，已經(jīng)成為今日結(jié)核病研究中的主要挑戰(zhàn)。

一、細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞的方式

結(jié)核分枝桿菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的病原體，能有效地在活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)生存，幾乎所有的結(jié)核感染均系通過呼吸道途徑吸入了含菌的顯微鏡下大小氣溶化微粒核心（5～10μm）而引起，即由于咳嗽、噴嚏或與有高度感染性的帶菌者講話而播散，只有那些小至不為支氣管黏膜纖毛所捕取而由空氣傳入的微粒，方可到達(dá)肺泡。因此。所有的微粒中，約有10%到達(dá)肺泡。小至能夠到達(dá)肺泡的微粒中所含有的細(xì)菌一般不超過3個(gè)。感染多發(fā)生于所謂原發(fā)性感染部位，在此有較多的氣流便于吸入細(xì)菌沉集。這些部位包括肺的上葉、中葉和肺尖的前部以及下葉的下部。細(xì)菌進(jìn)入肺泡后即為肺泡巨噬細(xì)胞所吞噬。吸入的細(xì)菌是否能引起感染取決于細(xì)菌的毒力與吞噬了細(xì)菌的肺泡巨噬細(xì)胞的固有殺菌能力。結(jié)核分枝桿菌是通過與幾種不同的細(xì)胞表面分子的結(jié)合而進(jìn)入巨噬細(xì)胞的。細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞的確切方式可以決定其在巨噬細(xì)胞中的命運(yùn)。結(jié)核分枝桿菌在進(jìn)入細(xì)胞以前可與4種以上不同的細(xì)胞表面受體結(jié)合。所有的補(bǔ)體受體都在結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞的結(jié)合上起作用。這些受體的抗體都能有效地抑制細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞的黏附和被其吞入。體外研究表明有許多涉及分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞的機(jī)制，包括通過補(bǔ)體替代活化途徑的C3對(duì)分枝桿菌的調(diào)理作用，后繼之以通過補(bǔ)體受體CR1，CR3和CR4的進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞。Schorey等證實(shí)人的補(bǔ)體裂解產(chǎn)物C2a可為結(jié)核分枝桿菌用以產(chǎn)生能促進(jìn)進(jìn)入巨噬細(xì)胞的調(diào)理素。

巨噬細(xì)胞可通過纖連蛋白黏附至分枝桿菌。巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體亦可通過非調(diào)理素介導(dǎo)的方式識(shí)別分枝桿菌表面的末端甘露糖殘基而參與結(jié)合與吞噬作用。這些殘基中研究較多者為脂阿拉伯糖甘露糖聚糖（LAM）。LAM是分枝桿菌的主要抗原性脂聚糖，由高度分枝的甘露糖和阿拉伯糖多聚物所組成，并連接至菌膜中的一寡甘露糖核心聚糖上。有毒力的分枝桿菌LAM有一附加的甘露糖殘基加帽（man－LAM），有別于快速生長(zhǎng)的非致病性分枝桿菌（ara－LAM）的生長(zhǎng)。這種加帽作用（capping）的有無能影響巨噬細(xì)胞應(yīng)答和細(xì)菌與巨噬細(xì)胞甘露糖受體的結(jié)合。在宿主肺防御功能上起作用的肺表面活性劑中的主要蛋白質(zhì)SP－A，已證實(shí)與結(jié)核分枝桿菌通過甘露糖受體以及特異性SP－A受體與巨噬細(xì)胞的結(jié)合有關(guān)。此外并證實(shí)革蘭陰性菌脂多糖信號(hào)傳遞受體CD14也與攝取未經(jīng)調(diào)理的結(jié)核分枝桿菌有關(guān)。但是這種攝取是否由CD14的已知受體L A M所介導(dǎo)則尚不清楚。

一般認(rèn)為，巨噬細(xì)胞的吞噬作用對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的生存和疾病的啟動(dòng)是必需的，不過細(xì)菌侵入非吞噬細(xì)胞，如呼吸道上皮細(xì)胞，對(duì)于病原菌的生存也是有利的。近期已克隆出一種能使非吞噬性的大腸埃希菌侵入上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞，并可在這些細(xì)胞中生存的結(jié)核分枝桿菌DN A片段。已發(fā)現(xiàn)結(jié)合肝素的血凝素黏附蛋白（HB H A）決定對(duì)2型肺細(xì)胞的侵入，并可因而決定結(jié)核分枝桿菌的肺外擴(kuò)散。因此，缺少hbha基因的細(xì)菌雖在正常情況下定居于肺臟，但卻不能在脾臟中定居。

二、結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞中的命運(yùn)

結(jié)核分枝桿菌在其所感染的多數(shù)人群中引起慢性無癥狀的感染。全世界人群中有1/3受到結(jié)核病的感染，但是只有10%發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核?？梢娝拗鞯拿庖邞?yīng)答能有效地控制分枝桿菌在其余人群中的復(fù)制。結(jié)核分枝桿菌可通過其能在巨噬細(xì)胞中無限期生存而維持這種慢性感染。這種情況部分上是由于致病性分枝桿菌即使在面對(duì)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答時(shí)仍具有能在敵對(duì)的巨噬細(xì)胞環(huán)境條件下生存的能力。其結(jié)果是，有一小部分活的和潛伏的分枝桿菌可以在肺部感染部位或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中持續(xù)存在。細(xì)菌可在數(shù)年的潛伏后又重新開始復(fù)制，導(dǎo)致臨床疾病的再次活化。分枝桿菌能在巨噬細(xì)胞中生存和復(fù)制的機(jī)制有多種。當(dāng)結(jié)核菌內(nèi)在化于巨噬細(xì)胞以后，就必須要能抵抗細(xì)胞內(nèi)任何固有的殺菌活性，使其能在此環(huán)境內(nèi)生存和引起持續(xù)性的感染。對(duì)于分枝桿菌能與巨噬細(xì)胞相互作用和使其能對(duì)抗宿主正常防御的分子機(jī)制進(jìn)行研究，在深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制上是至關(guān)重要的。

結(jié)核分枝桿菌破壞宿主巨噬細(xì)胞抗菌功能的機(jī)制可阻止溶酶體與已被感染吞噬體的融合，從而防止吞噬體中的酸化。一般被吞噬的物質(zhì)是內(nèi)在化于巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中以后在溶酶體中被消化，這樣就構(gòu)成有效的吞噬抗菌防御活性。在結(jié)核分枝桿菌的情況下則與之有所不同，活菌被吞噬后卻是與溶酶體分開的，但死菌則并非如此。這樣就使活菌能逃避與吞噬作用有關(guān)的抗菌活性的作用，而表現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)，提示細(xì)菌的生活力是抑制融合的因素。這樣可部分解釋結(jié)核分枝桿菌持續(xù)存在于宿主細(xì)胞和其不被免疫識(shí)別的原因。結(jié)核分枝桿菌尚可因抑制磷酸肌醇3－磷酸和Rab5效應(yīng)早期內(nèi)質(zhì)體自身抗原（EEA1）而防止巨噬細(xì)胞吞噬體的成熟。也有可能，有毒結(jié)核分枝桿菌也可離開吞噬空泡而進(jìn)入巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)，從而免于死亡。但是這一機(jī)制對(duì)細(xì)菌的生存上并不重要，而是有利于分枝桿菌組成進(jìn)行M HC－Ⅰ類途徑的抗原呈遞過程。

此外，關(guān)鍵性分枝桿菌蛋白質(zhì)的表達(dá)也可增強(qiáng)細(xì)菌適應(yīng)敵對(duì)的巨噬細(xì)胞環(huán)境的能力。例如，誘生熱休克蛋白（Hsp），如Hsp－60和Hsp－70，可以因其分子伴侶蛋白（chaperone）功能而有利于分枝桿菌蛋白質(zhì)的再折疊裝配和膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而細(xì)菌分泌的超氧化物歧化酶則可通過麻痹活化巨噬細(xì)胞生成的毒性超氧化物基團(tuán)而限制氧化應(yīng)激反應(yīng)的毒性效應(yīng)。一種與細(xì)胞壁相關(guān)的主要復(fù)雜脂多糖L A M，是細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生者，它在對(duì)抗巨噬細(xì)胞的抗菌機(jī)制上表現(xiàn)許多關(guān)鍵性功能，也是人和小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生T NFα的有效誘生物。T NFα是宿主針對(duì)分枝桿菌早期應(yīng)答中的重要組分，并與T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN－γ協(xié)同作用以刺激殺菌機(jī)制。然而來源于有毒菌株（man－LAM）和無毒菌株（ara－LAM）者在LAM的活性上有重要的差異。有毒結(jié)核分枝桿菌的man－LAM在誘生巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNFα的能力上遠(yuǎn)不及無毒分枝桿菌的ara－LAM。此外。man－LAM也不能活化與巨噬細(xì)胞早期活化有關(guān)的重要基因。

LAM還可使巨噬細(xì)胞的另一重要抗菌機(jī)制——呼吸暴發(fā)成為無效，這是LAM通過作用于對(duì)反應(yīng)性氧基和抑制吞噬細(xì)胞中氧化暴發(fā)的活化起重要作用的酶類所致。LAM的這種作用使細(xì)菌進(jìn)一步能在感染的巨噬細(xì)胞中增殖，因而LAM就成為分枝桿菌毒力的一種重要的決定因子。結(jié)核分枝桿菌尚可抵抗氧化暴發(fā)的抗菌作用，特別是能特異地抵抗反應(yīng)性氧中間產(chǎn)物（ROI）。但是至今尚無分枝桿菌能抵抗其他氧依賴性抗菌機(jī)制的報(bào)道，如反應(yīng)性氮中間產(chǎn)物（RNI）暴發(fā)，不過也發(fā)現(xiàn)有RNI抵抗性的菌株存在，而且在動(dòng)物模型和人類中都是毒力較大者。目前已在致病性的結(jié)核分枝桿菌臨床分離物中克隆出一新型基因，不論細(xì)菌在培養(yǎng)基中接觸了外界化合物或巨噬細(xì)胞中的內(nèi)源性產(chǎn)物時(shí)，這種基因在非致病性分枝桿菌中的表達(dá)都可增強(qiáng)細(xì)菌抵抗RNI和ROI的能力。

另有些事實(shí)表明，TGFβ（尤為TGFβ1同工型）和IL－10是來源于巨噬細(xì)胞的、決定宿主對(duì)分枝桿菌感染免疫應(yīng)答降低的主要細(xì)胞因子。TGFβ是目前已知最強(qiáng)的一種內(nèi)源性免疫抑制因子。結(jié)核分枝桿菌能誘發(fā)TGFβ和IL－10這些具有免抑制活性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以有利于其生存。這是因?yàn)樗鼈兡苷T導(dǎo)TGFβ1mRNA的表達(dá)以及為其感染細(xì)胞中活性蛋白質(zhì)的分泌，并可引起單核吞噬細(xì)胞中IL－10的表達(dá)，借以下調(diào)特異性共同刺激分子。在此情況下，結(jié)核分枝桿菌能對(duì)與決定抗分枝桿菌感染的保護(hù)性免疫有關(guān)的許多重要機(jī)制產(chǎn)生抑制作用。重要的是，TGFβ可以干擾重要的巨噬細(xì)胞殺菌機(jī)制，如小鼠中氮中間代謝產(chǎn)物和豚鼠及人類中反應(yīng)性氧中間代謝產(chǎn)物的生成。因?yàn)榻陙硪炎C實(shí)RNI在限制小鼠或肺泡巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的作用，TGFβ可能增強(qiáng)這些細(xì)胞中分枝桿菌的復(fù)制。這兩種細(xì)胞因子都對(duì)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，降低IL－1，IL－6，IL－12和IFN－γ的產(chǎn)生，所有的這些細(xì)胞因子都是重要的抗分枝桿菌效應(yīng)分子。

已有許多事實(shí)表明，結(jié)核分枝桿菌能長(zhǎng)期潛伏于宿主組織內(nèi)，但對(duì)潛伏結(jié)核分枝桿菌的生理狀態(tài)所知不多。近年研究證實(shí)潛伏分枝桿菌在厭氧生活時(shí)期可切斷蛋白質(zhì)的合成，但對(duì)恢復(fù)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的一些刺激仍可發(fā)生反應(yīng)。

三、結(jié)核病中的細(xì)胞免疫應(yīng)答

（一）巨噬細(xì)胞的作用

1.作為殺菌細(xì)胞　最終破壞結(jié)核分枝桿菌的效應(yīng)細(xì)胞是活化的巨噬細(xì)胞。但是人類單核巨噬細(xì)胞殺滅或抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的機(jī)制還不太清楚。氧依賴性和非依賴性機(jī)制都是活化巨噬細(xì)胞抗分枝桿菌功能的重要武器。氧依賴系統(tǒng)包括ROI（由巨噬細(xì)胞氧化性暴發(fā)介導(dǎo)）和RNI的產(chǎn)生。RNI是通過誘導(dǎo)性NO合酶（NOS2）的作用而使氨基酸L－精氨酸氧化，產(chǎn)生NO的高輸出途徑中形成的。NO合成的重要性已在嚙齒動(dòng)物巨噬細(xì)胞中得到充分的證明，認(rèn)為它是分枝桿菌感染中專職巨噬細(xì)胞抗菌活性的一種關(guān)鍵性成分。近年來證明活動(dòng)期結(jié)核病人的支氣管肺泡抽取液標(biāo)本的研究結(jié)果證明，NOS2至少也是人體內(nèi)巨噬細(xì)胞的抗分枝桿菌活性表現(xiàn)的一部分。

巨噬細(xì)胞的非氧依賴性殺菌機(jī)制包括巨噬溶酶體中的酸化、溶酶體酶類的活化、抗菌分子（如防御素）的產(chǎn)生以及營(yíng)養(yǎng)消除。單核巨噬細(xì)胞能合成和分泌許多炎癥介質(zhì)，它們?cè)谌庋磕[形成、增強(qiáng)炎癥和殺滅分枝桿菌上都起重要作用，并對(duì)其他效應(yīng)細(xì)胞表現(xiàn)強(qiáng)的趨化吸引作用，結(jié)核分枝桿菌能刺激許多巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵性細(xì)胞因子和趨化因子的基因表達(dá)和產(chǎn)生加強(qiáng)，從而通過復(fù)雜的相互作用而增強(qiáng)此種細(xì)胞的效應(yīng)和輔佐功能?！霸缙诜磻?yīng)”細(xì)胞因子腫瘤壞死因子－α（T NFα）在結(jié)核感染中的免疫保護(hù)作用已在小鼠模型和分枝桿菌疾病的體外模型中得到明確的證實(shí)，即可由于天然免疫系統(tǒng)早期限制細(xì)菌的生長(zhǎng)。不過在人類中T NFα也可表現(xiàn)一定程度的結(jié)核病所特有的組織損傷性免疫病理作用。在感染部位有T NFα及其受體的釋放，而且已證實(shí)T NFα是決定人類結(jié)核病熟知癥狀和體征（如體重下降、夜間盜汗和組織壞死等）的細(xì)胞因子之一。T N Fα活性的中和可導(dǎo)致臨床上的改善。Moreira等在一小鼠的結(jié)核模型中發(fā)現(xiàn)，選擇性部分使用T N Fα抑制物肽胺哌啶酮（thalidomide）的免疫調(diào)節(jié)能降低炎癥細(xì)胞因子的含量，并可同時(shí)減輕肺部的病理變化。

近年證實(shí)，來源于巨噬細(xì)胞的IL－12在對(duì)抗包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)寄生病原菌的宿主防御機(jī)制上起決定性的作用。它是作為對(duì)抗分枝桿菌感染而首先出現(xiàn)的宿主應(yīng)答之一，可以和T N F一起共用誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞（N K細(xì)胞）產(chǎn)生IFN－γ，便于1型輔助性T細(xì)胞（Th1）應(yīng)答的形成，并增強(qiáng)其細(xì)胞毒活性。這些機(jī)制在對(duì)抗結(jié)核保護(hù)性免疫的誘生上至關(guān)重要。同時(shí)也是對(duì)抗分枝桿菌早期天然免疫的決定性因素。近期在分枝桿菌疾病的小鼠模型中證實(shí)，遺傳易感的小鼠感染了分枝桿菌以后，IL－12和其他誘導(dǎo)IFN－γ細(xì)胞因子的表達(dá)下降。

早期細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)于天然免疫應(yīng)答的發(fā)生，使之在細(xì)胞免疫發(fā)生以前就可快速控制感染，并可通過促進(jìn)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能的表達(dá)而對(duì)獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答表現(xiàn)其誘導(dǎo)作用。趨化因子有可能在對(duì)結(jié)核的宿主免疫應(yīng)答的早期起重要作用，特別是在動(dòng)員單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群體，向感染部位移動(dòng)，以及啟動(dòng)肉芽腫的形成時(shí)。在人類和小鼠的研究中已證實(shí)了當(dāng)結(jié)核分枝桿菌被吞噬后即可誘生許多不同的趨化因子。例如，C－C趨化因子受體2的缺失可使小鼠的存活降低，而且這種情況與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞移動(dòng)至肺部能力上的缺陷有關(guān)。很有可能在人類結(jié)核中，促炎細(xì)胞因子及趨化因子成為在動(dòng)員和活化細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要作用的許多介質(zhì)的一部分，它們?cè)谌庋磕[形成和決定最后導(dǎo)致疾病發(fā)展或消退的免疫應(yīng)答類型中起作用。除了細(xì)胞因子以外，維生素D3也可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺滅細(xì)菌的能力，而且受到磷酸酰肌醇－3激酶和N APD H－依賴性氧化酶的調(diào)節(jié)。

2.作為抗原呈遞細(xì)胞　巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答中呈遞抗原至各種淋巴細(xì)胞亞群的一種重要的抗原呈遞細(xì)胞。分枝桿菌抗原與主要組織相容性Ⅰ類或Ⅱ類分子一起為CD4或CD8－αβT細(xì)胞受體（TCR）陽性的T細(xì)胞所識(shí)別。近年來已證明巨噬細(xì)胞可以與非多態(tài)性類似M HC的表面分子CD1b一起共同呈遞非肽性質(zhì)的分枝桿菌抗原，如L A M。這種呈遞作用是通過一種特殊的淋巴細(xì)胞——CD4－CD8－αβ^－T細(xì)胞完成的，這樣就構(gòu)成了另外的一種防御機(jī)制，也可能是早期天然免疫應(yīng)答的一部分。

近期鑒定的小鼠編碼天然抵抗力相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白－1（Nramp－1）的基因，使人們對(duì)巨噬細(xì)胞如何被調(diào)節(jié)以及在細(xì)胞內(nèi)感染中抗原的處理和提呈如何受到影響有了進(jìn)一步的了解。這種只表達(dá)于網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的基因表現(xiàn)細(xì)胞水平上的多范圍多效效應(yīng)，包括許多早期應(yīng)答細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)、NO的釋放、MHC－Ⅱ類分子和氧化呼吸暴發(fā)的上調(diào)等。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果明確提示Nramp－1表型是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的。Nramp是表達(dá)于巨噬細(xì)胞的溶酶體部分的一種完整的膜蛋白，而且在吞噬作用發(fā)生不久后即轉(zhuǎn)移至吞噬體，它可通過轉(zhuǎn)運(yùn)吞噬體抗菌功能所必需的金屬離子而增強(qiáng)對(duì)許多在抗原性上無關(guān)的細(xì)胞內(nèi)寄生物的殺滅能力，包括結(jié)核分枝桿菌。帶有Nramp－1感染易感突變株等位基因的小鼠不能控制細(xì)胞內(nèi)的感染。這種基因的人類中的同源物稱為Nramp－1，也是人類結(jié)核病中的一種強(qiáng)作用的候選基因，曾經(jīng)克隆化和作圖于人的35對(duì)染色體。Nramp－1的基因變異能影響對(duì)西非人群的涂片陽性結(jié)核病的易感性。但對(duì)南美人群則無影響。

（二）結(jié)核病中的T細(xì)胞

結(jié)核病是一種需要有T細(xì)胞來加以控制的原型感染。T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的協(xié)同作用在獲得抗分枝桿菌的保護(hù)性免疫上至關(guān)重要，而且與促炎細(xì)胞因子的環(huán)境有關(guān)。這是一種極為復(fù)雜的過程，涉及許多T細(xì)胞亞群，表現(xiàn)多種功能，包括遲發(fā)型超敏反應(yīng)、細(xì)胞裂解、保護(hù)性和記憶性免疫的誘導(dǎo)等。多數(shù)接觸了結(jié)核病的病人在開始的10周內(nèi)發(fā)生原發(fā)感染。此時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)烈的遲發(fā)型超敏反應(yīng)；表明有獲得性細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生，這種反應(yīng)一般認(rèn)為是T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞協(xié)同作用的結(jié)果，因?yàn)橹挥猩贁?shù)（5%～10%）新近感染者發(fā)展成為原發(fā)性疾病或在潛伏期后再次活化。

1.CD4＋T細(xì)胞　決定抗結(jié)核免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的原發(fā)性T細(xì)胞亞群為CD4＋T細(xì)胞?？狗种U菌的細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答是通過CD4＋T細(xì)胞釋放特異的細(xì)胞因子來完成的。在小鼠模型中有兩種不同的CD4＋T細(xì)胞群體，它們可根據(jù)其所分泌的細(xì)胞因子來區(qū)分。Th1型T細(xì)胞通過分泌IFN－γ和IL－2介導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；而Th2型T細(xì)胞則是通過分泌IL－4，IL－5和IL－10增強(qiáng)抗體產(chǎn)生。在小鼠模型中應(yīng)用基因剔除技術(shù)或中和抗體的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)力是由Th1型T細(xì)胞應(yīng)答所介導(dǎo)的，此外，IFN－γ的產(chǎn)生也是決定小鼠抗結(jié)核分枝桿菌過繼免疫的功能性標(biāo)記?？梢妼?duì)小鼠分枝桿菌感染的免疫抵抗力可能由Th1細(xì)胞介導(dǎo)，而Th2型細(xì)胞因子在抗分枝桿菌免疫上的可能作用尚未明確。

有些研究者報(bào)告，過度的Th2型T細(xì)胞應(yīng)答及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生常與缺陷性肉芽腫的形成和對(duì)結(jié)核感染抵抗力下降有關(guān)。對(duì)某些分枝桿菌感染易感的小鼠產(chǎn)生高水平Th2型的IL－4，而較少有IFN－γ。在另一相同的純系小鼠中則發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)針對(duì)鳥分枝桿菌Th1型應(yīng)答的細(xì)胞因子表達(dá)降低。其他的研究工作提示，原屬較強(qiáng)的抗結(jié)核的極化Th1型應(yīng)答可被下調(diào)而轉(zhuǎn)向Th2型T細(xì)胞應(yīng)答，這可能是由于巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放前列腺素和其他免疫抑制性細(xì)胞因子所致。這種Th2轉(zhuǎn)換在肺結(jié)核的晚期慢性肺炎期中尤為明顯，并可下調(diào)增強(qiáng)的Th1型T細(xì)胞所致的有害免疫病理后果，也可啟動(dòng)針對(duì)死的分枝桿菌的體液免疫應(yīng)答。Rook和Hernandez－Pando提出，如果Th2型應(yīng)答加上原已存在的Th1型應(yīng)答，則所形成的細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥部位就對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)的損傷變得極為敏感，從而使局部組織損傷加劇。

在以結(jié)核分枝桿菌感染的IL－6缺陷突變株小鼠模型中，可以證實(shí)細(xì)胞因子IL－6在抗結(jié)核保護(hù)性中的作用。基因剔除小鼠中的脾細(xì)胞能在體外細(xì)胞培養(yǎng)中使Th2型細(xì)胞因子IL－4水平上升和Th1型細(xì)胞因子IFN－γ水平下降，由所有的這些研究結(jié)果可知，Th2型細(xì)胞因子IL－4在抗分枝桿菌感染的保護(hù)性上并無直接作用。目前已有愈來愈多的事實(shí)說明人類中的抗分枝桿菌感染的免疫應(yīng)答同樣也是由分泌特異細(xì)胞因子程式的T細(xì)胞亞群所介導(dǎo)的。人類T細(xì)胞也如同上述的小鼠Th1和Th2細(xì)胞一樣也表現(xiàn)細(xì)胞因子分泌的二歧化程式。但是所發(fā)表的人類T細(xì)胞針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞因子產(chǎn)生的有關(guān)資料尚不一致。例如有的體外研究報(bào)告健康供血者的分枝桿菌－反應(yīng)性T細(xì)胞克隆可分泌IFN－γ和IL－2，但很少有IL－4和IL－5；而另有人報(bào)告多數(shù)結(jié)核分枝桿菌－反應(yīng)性T細(xì)胞克隆產(chǎn)生Th1和Th2細(xì)胞因子。不過較為有意義的研究是對(duì)感染部位細(xì)胞因子應(yīng)答的評(píng)估。胸膜結(jié)核是一種自愈性感染，是研究局部保護(hù)性免疫的良好模型。其特點(diǎn)是有抗原特異性、能分泌IF N－γ和細(xì)胞毒活性的CD4＋T細(xì)胞移動(dòng)至胸膜部位。

人類結(jié)核中Th1應(yīng)答的下降是否為免抑制性細(xì)胞因子，如TGFβ和IL－10的過量產(chǎn)生以及IL－10和IL－12受體表達(dá)上的差異所致，而不是由于直接的Th1/Th2平衡失調(diào)所致，將是一個(gè)十分有意義的問題。這些細(xì)胞因子在適當(dāng)濃度下可下調(diào)免疫應(yīng)答，并且可限制組織損傷的程度。相反，如果這些免疫抑制性細(xì)胞因子過量產(chǎn)生，則不能控制感染。

2.CD8＋T細(xì)胞　另一與控制結(jié)核分枝桿菌感染有關(guān)的細(xì)胞免疫組分為CD8＋T細(xì)胞。這種細(xì)胞是另外的一類表達(dá)α－βT細(xì)胞受體的T細(xì)胞，能識(shí)別由M H C－Ⅰ類分子所提呈的抗原肽，并與之發(fā)生反應(yīng)。小鼠中通過M HC－Ⅰ類分子表面表達(dá)所必需基因的基因突變而有選擇性地消除CD8＋T細(xì)胞或喪失有功能活性的CD8＋T細(xì)胞時(shí)，當(dāng)其感染結(jié)核時(shí)常很快地死亡。雖CD8＋T細(xì)胞的主要作用為細(xì)胞毒反應(yīng)，但是這一功能在抗結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性上并非必需。因?yàn)閷?duì)小鼠中編碼決定細(xì)胞毒功能誘導(dǎo)分子的兩個(gè)基因之一進(jìn)行定向破壞，并不能使其較之野生型小鼠有對(duì)結(jié)核更高的易感性。

CD8＋T細(xì)胞也可產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，其中也包括IFN－γ，正是由于這種細(xì)胞因子的產(chǎn)生也就決定了CD8＋T細(xì)胞的存在在抗結(jié)核保護(hù)性中是必需的。人類的CD8＋T細(xì)胞在分枝桿菌抗原的刺激下或在活動(dòng)肺結(jié)核感染時(shí)都可發(fā)生增殖，CD8＋細(xì)胞在被感染的肺泡處擴(kuò)增，并且與局部宿主防御和疾病的免疫病理機(jī)制有關(guān)。另外CD8＋T細(xì)胞也可在結(jié)核病的組織損傷免疫病理中起作用，因研究表明在具有廣泛組織壞死結(jié)核病人的外周血中含有大量的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。BCG免疫接種后，CD8＋T細(xì)胞活化，并且在抗結(jié)核的保護(hù)性免疫中起主動(dòng)作用。

3.γ－δT細(xì)胞　T細(xì)胞抗原受體（TCR）提供T淋巴細(xì)胞識(shí)別各種抗原的能力。有兩類不同形式的TCR，由多種α－β或γ－δ異二聚體組成，并與不變性CD3構(gòu)成復(fù)合體。γ－δT細(xì)胞是在抗結(jié)核細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要作用的第二個(gè)主要T淋巴細(xì)胞亞群，并占循環(huán)血T淋巴細(xì)胞的1%～5%。γ－δT細(xì)胞能識(shí)別非肽類性質(zhì)的分枝桿菌配體，這種識(shí)別并不依賴于巨噬細(xì)胞上的M H C分子。其活化依賴于輔佐細(xì)胞，這是人的肺泡巨噬細(xì)胞所表現(xiàn)的一項(xiàng)功能。只有整個(gè)分枝桿菌組成誘發(fā)γ－δT細(xì)胞的增殖，因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌的PPD只能通過TCR誘發(fā)α－β^－CD4＋細(xì)胞應(yīng)答。這些γ－δT細(xì)胞大量聚集于結(jié)核病變內(nèi)。與CD4＋－α－βT細(xì)胞一樣，γ－δT細(xì)胞對(duì)分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)活性，并可產(chǎn)生大量的IFN－γ。上皮和黏膜表面γ－δ細(xì)胞的存在和其由活的分枝桿菌活化，提示此種細(xì)胞可以形成抗結(jié)核分枝桿菌早期免疫的第1道防線。

（三）其他免疫細(xì)胞在宿主抗結(jié)核應(yīng)答中的作用

第3類淋巴細(xì)胞不表達(dá)T細(xì)胞或B細(xì)胞的標(biāo)記。這些較大的淋巴細(xì)胞稱為自然殺傷（NK）細(xì)胞，在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多顆粒，并可在無明顯的抗原刺激下裂解感染的細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)存在的細(xì)菌，如結(jié)核分枝桿菌能直接或通過刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL－12而活化NK細(xì)胞，IL－12是一種強(qiáng)的活化NK細(xì)胞的細(xì)胞因子。NK細(xì)胞也可產(chǎn)生IFN－γ，并通過其活化巨噬細(xì)胞來增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)吞入分枝桿菌的殺滅。近期的研究工作表明，NK細(xì)胞產(chǎn)生的IFN－γ在原發(fā)性宿主防御、抗分枝桿菌保護(hù)性免疫以及對(duì)抗分枝桿菌感染有關(guān)細(xì)胞的誘導(dǎo)上都起決定性的作用。此外，有T細(xì)胞基因缺陷的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的小鼠仍可使巨噬細(xì)胞向感染部位移動(dòng)，并且在無功能性T細(xì)胞存在的情況下，亦可形成有明顯組織性的肉芽腫，提示這可能是由分泌IFN－γ的NK細(xì)胞所介導(dǎo)的作用所致。由此可見，NK細(xì)胞是可能通過誘發(fā)肉芽腫形成和巨噬細(xì)胞活化，而在特異性免疫出現(xiàn)以前所形成的早期防御機(jī)制。

巨噬細(xì)胞所帶有的典型MHC分子以及其他系統(tǒng)，在生成結(jié)核分枝桿菌－特異性細(xì)胞應(yīng)答上是必需的。CD1是一種類似MHC的表面分子，參與T細(xì)胞的抗原識(shí)別，有提呈非肽抗原（如類脂和脂聚糖）的特殊能力。CD1－限制性的T細(xì)胞包括帶有α－βTCR的CD4－CD8－雙陰T細(xì)胞以及CD8細(xì)胞和帶有γ－δTCR的細(xì)胞。雙陰T細(xì)胞雖可使分枝桿菌感染的靶細(xì)胞裂解，但是這種細(xì)胞毒機(jī)制并不能引起靶細(xì)胞內(nèi)存在的分枝桿菌的死亡，但可將細(xì)菌釋出，便于活化的巨噬細(xì)胞在低感染復(fù)數(shù)下攝取。此種T細(xì)胞亞群主要在免疫調(diào)節(jié)上起作用，特別是可消除表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞上的抗原，從而下調(diào)免疫介導(dǎo)的組織損傷。

呼吸道中尚含有一種在肺部免疫應(yīng)答生成中起重要作用的細(xì)胞群體，稱為樹突狀細(xì)胞（DC）。肺部DC有很強(qiáng)的抗原呈遞能力以誘發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫，能表達(dá)高水平的抗原呈遞性的Ⅰ類和Ⅱ類MHC產(chǎn)物以及CD1分子。DC的前身細(xì)胞能吞噬分枝桿菌，并能有效地呈遞抗原至T細(xì)胞。DC在肺臟中的一種主要的機(jī)制性特征為其可捕捉抗原，然后移送至引流淋巴結(jié)，用以誘發(fā)免疫?；罹腥拘∈蠛筮M(jìn)入淋巴結(jié)中方有DC的聚集，而牛型分枝桿菌BCG的死菌制劑就不能誘發(fā)這種現(xiàn)象，說明DC在抗分枝桿菌的獲得性保護(hù)性上起重要作用。

中性粒細(xì)胞在宿主抗分枝桿菌感染應(yīng)答中的作用尚不清楚，但是很有可能也與之有關(guān)。特別是在炎癥反應(yīng)的早期。另外，肺泡上皮細(xì)胞可在肺部炎癥中起作用，在宿主的抗分枝桿菌感染的免疫應(yīng)答中也可能起一定的作用。

四、結(jié)核病中的肉芽腫炎癥——細(xì)胞相互作用和組織損傷性免疫機(jī)制

結(jié)核病中T細(xì)胞的持續(xù)活化將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)感染組織學(xué)標(biāo)志的肉芽腫形成。吞噬細(xì)胞的移動(dòng)與活化形成有組織的肉芽腫，是對(duì)各類感染抵抗力主要成分的一種動(dòng)態(tài)過程，在微生物感染中尤為重要。此種形式的炎癥反應(yīng)可用以局限和防止結(jié)核菌的擴(kuò)散。但它也可由于組織壞死而引起嚴(yán)重的功能不全。如其發(fā)生于肉芽腫的中央，則稱為干酪樣壞死，這種壞死是由于巨噬細(xì)胞產(chǎn)物（如溶酶體中的酶類）和ROI所引起的。干酪樣肉芽腫和與肉芽腫一起發(fā)生的纖維化是結(jié)核病中組織病理和臨床疾病的主要原因。

結(jié)核菌生長(zhǎng)與宿主免疫應(yīng)答之間的相互作用決定疾病的發(fā)展或消退。家兔模型中的結(jié)核與人體中的疾病比較接近；結(jié)核病的各個(gè)時(shí)期都可用組織學(xué)技術(shù)在此種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行研究。第1期是結(jié)核分枝桿菌被吸入后在肺泡巨噬細(xì)胞中所發(fā)生的感染。取決于肺泡巨噬細(xì)胞殺菌能力與結(jié)核分枝桿菌毒力，巨噬細(xì)胞多能消滅結(jié)核分枝桿菌。這些殺滅機(jī)制是巨噬細(xì)胞的天然抵抗力功能，在此期中與細(xì)胞免疫無關(guān)。如果原始被感染的巨噬細(xì)胞不能消滅感染的細(xì)菌，細(xì)菌就能分裂，這些巨噬細(xì)胞最終被破壞，釋出細(xì)菌，并可被新近由血流中進(jìn)入的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞所吞噬。即使在感染1周后，對(duì)感染有抵抗力家兔肺中所含有的活菌仍較易感家兔肺中所含有者少20倍。

在以后的2周內(nèi)發(fā)生共生性相互關(guān)系，即新的巨噬細(xì)胞聚集；在易感性和抵抗性的家兔品系中都發(fā)生對(duì)數(shù)期速率的增殖。在組織學(xué)上，易感動(dòng)物病變中的巨噬細(xì)胞多位于肺泡內(nèi)，且其中含有較多的活菌；而抵抗動(dòng)物病變中者則常位于肺間質(zhì)中，有抵抗性家兔的間質(zhì)性炎癥浸潤(rùn)由無數(shù)在免疫應(yīng)答上起主要作用的淋巴細(xì)胞所組成。自3周以后，即可出現(xiàn)乳酪樣壞死的中心，此時(shí)就可終止細(xì)菌繁殖的對(duì)數(shù)期，并與遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間符合。易感動(dòng)物則有更多、更大的含有更多細(xì)菌的乳酪樣壞死中心。壞死中心的發(fā)生是由于未活化巨噬細(xì)胞的破裂而引起的局部組織損傷。其目的在于消除可供細(xì)菌生長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。這種反應(yīng)可能是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性的結(jié)果。

在免疫應(yīng)答的以后時(shí)期中，雖然易感和抵抗性家兔品系均能同樣控制細(xì)菌的繁殖，但易感動(dòng)物中的肉芽腫病變?cè)龃?，結(jié)核菌可以從病變的邊緣釋出，僅被活化不良的巨噬細(xì)胞所吞噬。這類宿主能用以控制感染擴(kuò)散的唯一機(jī)制是進(jìn)一步破壞組織的細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答，逐漸地破壞肺部，并可使細(xì)菌沿淋巴管和血流擴(kuò)散。這種情況與人類中的粟粒性結(jié)核相似。與之不同的是，有抵抗力的家兔的可產(chǎn)生由相應(yīng)巨噬細(xì)胞擴(kuò)增T細(xì)胞群體而誘發(fā)強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，所發(fā)生的肉芽腫病灶中就含有一層高度活化的巨噬細(xì)胞和小的乳酪樣病變中心周圍T淋巴細(xì)胞的聚集。這些由T細(xì)胞細(xì)胞因子（如IFN－γ）所活化的巨噬細(xì)胞能吞食和破壞由肉芽腫邊緣釋出的細(xì)菌，并可阻止進(jìn)一步的組織破壞。原發(fā)性結(jié)核最終即被包圍且發(fā)生退化，使疾病能在早期得以被控制。

如果疾病繼續(xù)發(fā)展，則在人類、家兔和豚鼠中都可發(fā)生固相干酪樣結(jié)核病變的液化，最后可形成空洞。這可能是人類結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制中最為危險(xiǎn)的過程，因?yàn)榇藭r(shí)有可能通過咳嗽反射使結(jié)核菌氣溶化，從而感染其他易感人群。此外，凡是既往的有效獲得性宿主抵抗力所不能控制的細(xì)菌即可大量繁殖，增加了形成具有抗宿主抵抗力的突變性細(xì)菌的可能性?？斩吹耐鈬谋谟赡z原蛋白的外帶所組成。它是一種富含毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及一軟性的液化中心。引起液化的原因尚不清楚，但液化常與高水平的結(jié)核菌素反應(yīng)性和含有高濃度的能水解固相乳酪樣病變物質(zhì)的蛋白酶裂解成熟巨噬細(xì)胞的過程有關(guān)。很有可能，這也可能是某些炎癥細(xì)胞因子，如IL－1和T NFα活性上調(diào)的間接后果。

Orme提出，人類、家兔和豚鼠對(duì)空洞形成易感性的增高反映了淋巴細(xì)胞在分枝桿菌感染的早期有效集中于肉芽腫的能力下降。液化的乳酪樣病變物質(zhì)對(duì)于能在細(xì)胞外生長(zhǎng)的分枝感菌而言是一種極好的培養(yǎng)基。如果空洞病變累及附近的支氣管，亦可發(fā)生壞死、破裂，并形成空洞，因此干酪樣病變物質(zhì)可排出，并沿支氣管擴(kuò)散至肺的其他部位以及外界環(huán)境之中。如果血管位于空洞壁，則當(dāng)侵蝕物破裂時(shí)即可導(dǎo)致出血和咯血的典型癥狀。這種咯血有時(shí)是大量的和致命性的。

五、結(jié)核病與HIV的相互關(guān)系

與許多感染HIV陽性病人的微生物不一樣，結(jié)核分枝桿菌是一種有毒力的病原菌，因而在具有極低免疫抑制的個(gè)體中亦可引起疾病。就兩種感染的流行資料而言，新近統(tǒng)計(jì)資料估計(jì)約有500萬以上的同時(shí)為兩種疾病感染者。結(jié)核病對(duì)潛伏感染T細(xì)胞中的HIV復(fù)制是一種強(qiáng)的活化因素，能導(dǎo)致病毒含量的增加和加速免疫系統(tǒng)的破壞。因此，對(duì)新近診斷為結(jié)核病人HIV狀態(tài)的了解至關(guān)重要，因?yàn)樗蓻Q定抗反轉(zhuǎn)錄病毒和抗結(jié)核治療是否要開始進(jìn)行，從而增強(qiáng)病人的生存力。

與HIV相關(guān)的免疫抑制惡化時(shí)，結(jié)核病就成為一種更易于擴(kuò)散的疾病，使免疫應(yīng)答減弱，空洞形成較少，病變多不局限于肺尖，肺外疾病較為多見。HIV陽性病人的活動(dòng)性結(jié)核放射學(xué)表現(xiàn)不典型，肺結(jié)核放射顯影表現(xiàn)和CD4T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)之間有明顯的聯(lián)系。CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)低的病人在胸部X線片中常表現(xiàn)有胸內(nèi)淋巴結(jié)病、胸膜積液、粟粒性或間質(zhì)性病變。而空洞形成和肺不張則較為少見。雙重感染病人的支氣管抽取液標(biāo)本的檢查研究發(fā)現(xiàn)，與免疫應(yīng)答正常的結(jié)核病人的抽取液相比較，所有類型肺中的免疫細(xì)胞數(shù)目都有所下降，特別是CD4＋T細(xì)胞。這可能是限制有效的局部免疫應(yīng)答的形成的一種因素，使向肺外早期擴(kuò)散的危險(xiǎn)性增加。

很有可能HIV相關(guān)結(jié)核病人與免疫正常的結(jié)核病人相比較，在顯微鏡下的免疫組織學(xué)發(fā)現(xiàn)上也有所不同。在HIV感染的結(jié)核病人中，肉芽腫形成不良，在整個(gè)肉芽腫中只可見有未成熟的巨噬細(xì)胞的分散存在，以及少數(shù)的CD8＋T細(xì)胞。

總之，同時(shí)感染HIV的結(jié)核病人對(duì)新近感染和潛伏疾病的再活化的危險(xiǎn)性都有所增加。雖HIV－相關(guān)性結(jié)核病對(duì)免疫正常者并不具有更高的感染性，但耐藥菌株則較為多見，這樣就造成了公共衛(wèi)生方面的危險(xiǎn)性。

六、結(jié)核分枝桿菌的基因和毒力

至2001年，研究者對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和另一臨床分離菌株的全部基因組已進(jìn)行了測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)這一細(xì)菌約含有4 000個(gè)基因。而且很多的基因組均與類脂生成和類脂裂解的酶類有關(guān)。此外也在結(jié)核分枝桿菌基因組中鑒定出毒力基因，如“細(xì)胞溶解素基因”，這種基因與已知致病性細(xì)菌菌株的基因，如伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）的YpIQ溶血素基因之間有序列上的同源性。這些基因能編碼可溶性蛋白質(zhì)，它們可將病原菌空泡組分中的抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞質(zhì)中的抗原處理和抗原呈遞部位。

研究者并已證實(shí)了某些一線抗結(jié)核藥物突變上的基因作用，如編碼異煙肼耐藥表型的觸酶－過氧化物酶基因katG。另外的研究發(fā)現(xiàn)了許多在結(jié)核病宿主－病原菌相互作用上有意義的過程，使病原菌能獲得抵抗宿主活化巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生毒性分子的能力。已由致病性結(jié)核病臨床分離菌中克隆出能對(duì)抗巨噬細(xì)胞抗菌產(chǎn)物并有利于感染時(shí)病原菌生存的新型基因。

近年研究證實(shí)潛伏性分枝桿菌可利用脂肪酸作為碳和能量的來源。應(yīng)用基因信息可鑒定出分枝桿菌酶異檸檬酸鹽裂合酶。這種酶是脂肪酸代謝能量產(chǎn)生關(guān)鍵途徑中的乙醛酸支路（glyoxylate shunt）的主要作用物。如用同源重組法將結(jié)核分枝桿菌菌株中編碼此種酶的基因剔除，則所形成突變菌株的毒力明顯的減弱。在小鼠模型中證實(shí)，這一菌株在體內(nèi)不能保持原有的潛伏時(shí)期，諸如此類的基因研究可用以了解分枝桿菌的持續(xù)性感染和毒力的分子機(jī)制。

七、結(jié)核病分子診斷的新技術(shù)

就臨床醫(yī)生而言，結(jié)核病的診斷上有兩方面的主要問題：第一，如果病人的涂片檢查不是陽性，則醫(yī)生就必須等待數(shù)周，以期獲得培養(yǎng)檢查的結(jié)果。此外，在很多情況下無法鑒定細(xì)菌，以致醫(yī)生無法知道細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。第二，即使是感染在開始時(shí)就已經(jīng)為顯微檢查證實(shí)，但仍必須等待漫長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)結(jié)果，以期鑒別結(jié)核分枝桿菌與其他類型的分枝桿菌。

目前已有可能用測(cè)定特異DN A或RN A的DN A探針以核酸雜交方法來鑒定主動(dòng)生長(zhǎng)的分枝桿菌。其中有一系統(tǒng)（Accuprobe，GenProbe，San Diego，CA）即是基于互補(bǔ)性的核酸鏈與細(xì)菌RN A連接以形成穩(wěn)定的特異性雙鏈復(fù)合物的能力而設(shè)計(jì)的，這種方法能在2 h內(nèi)鑒定結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)物。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種快速和敏感的方法，可在不需進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)菌的情況下鑒定病原菌。PCR是基于用熱穩(wěn)定的DN A聚合酶對(duì)病原菌特異的DN A片段進(jìn)行級(jí)數(shù)擴(kuò)增和以后的測(cè)定。標(biāo)本的制備、DN A擴(kuò)增和檢測(cè)可以在一個(gè)工作日內(nèi)完成，理論上標(biāo)本中只要有一個(gè)細(xì)菌即可被檢出，但實(shí)際上的限度為10～1 000個(gè)細(xì)菌。已有許多關(guān)于應(yīng)用PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，其中應(yīng)用了許多不同的靶基因。但尚無一良好的單一靶序列可供臨床檢驗(yàn)使用。RN A聚合酶β亞單位的核心部位——RpoB序列可用以協(xié)助常規(guī)微生物診斷技術(shù)。

常用的靶序列為IS6110。這一序列對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體有特異性，可提供多種作用靶以備擴(kuò)增，近期對(duì)以IS6110作為PCR的作用靶的評(píng)估確定，原先選作為擴(kuò)增的區(qū)域雖對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體是特異的，但是這一序列的某些區(qū)域也可與其他菌種的插入序列共有同源性。因此在設(shè)計(jì)基于IS6110擴(kuò)增的新型PCR時(shí)務(wù)必注意。

用PCR法擴(kuò)增16S核糖體RN A基因超變區(qū)的一部，再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可在2～3 d內(nèi)鑒定分枝桿菌臨床分離物的培養(yǎng)菌株。然后可根據(jù)所獲得的種特異性核苷酸序列鑒定菌種。進(jìn)來已應(yīng)用這一技術(shù)直接從臨床標(biāo)本和組織標(biāo)本中鑒定分枝桿菌。

近年Roche分子系統(tǒng)發(fā)展了一種新的PCR檢定法（Amplicor結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)），這種方法用生物素化的菌屬特異性引物擴(kuò)增編碼16S核糖體RN A基因的DN A序列，然后用一結(jié)合于微孔板的對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體特異的寡核苷酸探針進(jìn)行試驗(yàn)。整個(gè)操作過程能在收到已處理標(biāo)本后的5～6 h內(nèi)完成。

另外也有人提出了基于抗原特異性T細(xì)胞的檢定法，此法在檢查新近接觸結(jié)核分枝桿菌而無癥狀的個(gè)體時(shí)，優(yōu)于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)。他們用結(jié)核分枝桿菌特異性ESA T－6分泌的抗原進(jìn)行ELISPOT檢定法以檢測(cè)抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這種檢定法與接觸強(qiáng)度的增加有明顯的相關(guān)性。

雖然臨床標(biāo)本的顯微鏡檢查和培養(yǎng)法在結(jié)核病的診斷上，多年來一直被認(rèn)為是有效的方法，應(yīng)用PCR和DNA序列鑒定則為快速診斷、流行病學(xué)研究以及快速鑒定耐藥菌株提供更為有效的方法。

（余傳霖）

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