植物病原細(xì)菌革蘭氏染色分析

時(shí)間：2023-09-25 理論教育版權(quán)反饋

【摘要】：革蘭氏陽性細(xì)菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性細(xì)菌呈紅色。（三）注意事項(xiàng)1.酒精脫色是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度，陽性菌則被誤染成陰性菌。

一、目的要求

認(rèn)識(shí)植物病原細(xì)菌的形態(tài)和菌齡特征，學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌革蘭氏染色的方法，熟悉細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏染色的基本原理。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.供試菌種

白菜細(xì)菌軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）的斜面培養(yǎng)（待測菌），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面培養(yǎng)（陽性對照菌），甘藍(lán)黑腐病菌（Xanthomonas campestris pvc.ampestris）的斜面培養(yǎng)（陰性對照菌）。

供試菌種必須在使用前5d移植，臨用前18~24h再轉(zhuǎn)試管1次，以保證菌體處于分裂活躍時(shí)期。

2.染液

（1）結(jié)晶紫草酸銨染劑

溶液I（結(jié)晶紫2.0g，95%的酒精20m L），溶液II（草酸銨0.8g，蒸餾水80m L），混合溶液I和II，濾紙過濾，貯存于試劑瓶中，24h后使用。

（2）魯戈?duì)柕庖?/p>

碘1.0g，碘化鉀2.0g，蒸餾水300m L。

將碘和碘化鉀放入同一研缽中研磨，研磨時(shí)緩慢加水直至碘和碘化鉀溶解，然后加水稀釋到300m L，裝入棕色試劑瓶，放于暗處備用。

（3）復(fù)染劑

先配制原液，用蒸餾水稀釋后為復(fù)染劑。

原液：番紅O（藏紅）2.5g，95%的酒精100m L。

復(fù)染劑：原液10m L，蒸餾水90m L。

（二）實(shí)驗(yàn)用具

移植餌、無菌水、顯微鏡、吸水紙、清潔試管、鑷子、清潔無脂載玻片、脫脂棉、草紙、裝有酒精的試管等。

三、內(nèi)容和方法

（一）實(shí)驗(yàn)原理

革蘭氏染色是丹麥病理學(xué)家Gram于1884年創(chuàng)立的，是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法，這種方法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性細(xì)菌（G＋菌）和革蘭氏陰性細(xì)菌（G-菌）。革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后發(fā)生脫水使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部分細(xì)胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑變大，不能阻止溶劑透入，因結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被洗去而脫色。最后革蘭氏陽性細(xì)菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性細(xì)菌呈紅色。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.配制菌懸液

用無菌蒸餾水將培養(yǎng)18~24h的菌種配制成菌懸液。

2.涂片、固定

在潔凈無脂的載玻片上，用移菌餌取菌液涂片，在同一張載玻片上分別涂上枯草芽孢桿菌（G＋菌對照）、甘藍(lán)黑腐病菌（G-菌對照）和白菜細(xì)菌軟腐病菌（待測菌）（圖12-1），晾干后在酒精燈火焰上通過2次，固定涂片，并寫上標(biāo)記。

圖12-1 涂片示意圖

3.染色

在涂片上滴加結(jié)晶紫草酸銨染劑（覆蓋三條菌膜），染色1min。

4.水洗

用水沖去染色劑，輕輕甩去載玻片上的水，用吸水紙吸干。

5.媒染

滴加魯戈?duì)柕庖海旧?min。