一、甲型肝炎病毒

甲型病毒性肝炎（viral hepatitis A）是由甲型肝炎病毒（HAV）污染的飲水、食品、用具以及手等，通過糞-口途徑傳播，以肝臟損傷為主的急性傳染病。在發(fā)展中國家的農(nóng)村和不發(fā)達(dá)國家，HAV的感染率和甲肝的發(fā)病率高，而且常常發(fā)生甲肝的暴發(fā)流行。HAV顆粒非常穩(wěn)定，是直徑27～32nm的20面體立體對稱的圓球顆粒，無囊膜，病毒表面是由32個(gè)亞單位構(gòu)成的殼粒。HAV的核酸為單股正鏈RNA，有感染性。HAV有空心和實(shí)心兩種，空心的缺乏核酸。HAV病毒是一種具有獨(dú)特性質(zhì)的小核糖核酸病毒，其遺傳學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，只有一個(gè)血清型，HAV有7個(gè)基因型。HAV在分子水平上的生物學(xué)機(jī)制與其他小核糖核酸病毒相距甚遠(yuǎn)。

1．樣品的處理

（1）水樣：采用逐步濃縮置0．1mol／L PBS（pH7．2）透析液中過夜（4℃）其間換3次PBS，蔡氏濾器（d＝0．22 nm）除菌，分裝于小青瓶中（－20℃保存）。

（2）食品：采集可疑食品，粉碎，用Tris緩沖液（pH＝7．4）制成懸液，離心，收集上清進(jìn)一步用CsCl做等密度超離心，產(chǎn)物－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

（3）血液：采集病人血液，離心取血清后加入PEG-6 000至10％，NaCl至2．3％，4℃沉淀過夜，第二天10000 r／min離心10分鐘，沉淀－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

（4）糞便：按Linemeyer等改良法，甲肝病人糞便懸于TNE-SLS中，加玻璃珠少許，震蕩均勻5 000 r／min離心10分鐘，取上清，加等體積的氯仿10 000 r／min，離心取上清，加PEG-6 000至10％，NaCl至2．3％，4℃沉淀過夜，第二天10 000 r／min離心10分鐘，沉淀即為較純的HAV病毒。

（5）組織：取肝組織，研磨制成勻漿，低速離心除去廢渣，用CsCl做等密度超離心。

（6）淤泥：將逐步濃縮后的樣品溶液的pH調(diào)至8．0，10 000 r／min離心30分鐘（4℃），取上清調(diào)至pH7．0按前述的方法透析過夜，取透析后的樣品2ml，用等體積的氯仿抽提，苯酚抽提兩次，等體積的異丙醇沉淀核酸（－50℃，20分鐘）15 000 r／min離心15分鐘，75％的乙醇洗滌一次，溶解于10ml的蒸餾水中。

2．甲肝檢測技術(shù)

（1）血清學(xué)檢測：抗HAV-IgM抗體是早期診斷的指標(biāo)，常用于檢測抗HAV-IgM抗體，方法有放射免疫法RIA和ELSIA法等，另外，抗HAV-IgG抗體雙份血清的4倍增長檢測可用于確診甲肝感染。

（2）病毒培養(yǎng)：HAV能夠在多種培養(yǎng)細(xì)胞中增殖，目前主要應(yīng)用的細(xì)胞株有恒河猴胚腎細(xì)胞（FRHK-4）和人成纖維細(xì)胞（2139）等。HAV在培養(yǎng)細(xì)胞中繁殖緩慢，在適應(yīng)過的細(xì)胞中培養(yǎng)20天左右可獲得大量病毒。HAV敏感動物主要是靈長動物，如黑猩猩、絨猴、獼猴等，口服或靜脈注射病毒均可感染動物，有甲肝癥狀的，糞便中可檢出病毒。

（3）免疫電鏡檢測：采集甲肝病人潛伏期末和穩(wěn)定期初的糞便標(biāo)本制成提取液，與甲肝抗血清混合，經(jīng)孵育，超離心等處理后制片，在電鏡下觀察。

（4）膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）：是近年來發(fā)展起來的一種快速免疫學(xué)檢測技術(shù)，用膠體金標(biāo)記單克隆鼠抗人IgM抗體檢測甲型肝炎特異性抗體，操作簡單，特異性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果直接可靠。

（5）核酸檢測：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性的HAV核酸引物，可直接檢測糞便和血清標(biāo)本中的病毒核酸。

3．流行病學(xué)調(diào)查分型技術(shù)

（1）血清學(xué)調(diào)查：抗HAV-IgG在急性期后期和恢復(fù)期早期出現(xiàn)，它在體內(nèi)持續(xù)存在多年甚至終身。當(dāng)抗HAV-IgG滴度在恢復(fù)期比急性期升高4倍以上時(shí)，可確診為甲肝。抗HAV-IgG可用于測定人群免疫水平，對流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。

（2）分型：HAV可分為7個(gè)基因型，其中Ⅰ，Ⅱ和Ⅶ型主要為人源HAV，Ⅲ型為人源或猴源HAV，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ則為猴源HAV。目前流行或散發(fā)的人源HAV中80％為Ⅰ基因型（ⅠA和ⅠB），約19％為Ⅲ型（ⅢA或ⅢB），其他型則很少。HAV基因組的VP1／2A區(qū)（翻譯區(qū)）是次保守區(qū)，已被國際上公認(rèn)為研究基因型的靶。HAV各基因型VP1／2A區(qū)核酸差異為15％～25％，各亞型間的差異為7．5％～15％?；蚍中头椒ǖ囊褟V泛應(yīng)用于分子流行病學(xué)調(diào)查。因此基因分型方法主要依托RT-PCR和核酸序列測定比較技術(shù)，包括HAV核酸提取RNA、反轉(zhuǎn)錄、針對VP1／2A區(qū)的PCR、PCR產(chǎn)物測序、序列差異比較等步驟。