第四節(jié)　尿液蛋白分析

持續(xù)蛋白尿是腎臟損害的一個重要標志。對尿蛋白做進一步的分析，不僅包括定量，還要對其性質做進一步的分析，以鑒別這些蛋白的來源，對于腎臟疾病的定位診斷是非常重要的，對某些微量蛋白的檢測還可以發(fā)現一些疾病的早期信號。

一、尿蛋白的定性分析

大多患者是通過該實驗首先獲得尿中存在蛋白的，包括定期的體檢。定性實驗不能確定蛋白量的多少和蛋白的性質，所以它只是一個過篩檢查。

（一）試紙法

本法快速、簡捷，基本能反映尿中蛋白的量，但容易受到干擾物的影響，使結果偏離，甚至造成假陽性或假陰性。詳見尿常規(guī)中干化學法。

（二）加熱醋酸法

是利用加熱使蛋白質變性凝固，再加酸使尿液pH下降達到等電點（pH4．7），使蛋白質完全沉淀，同時可以消除尿中某些磷酸鹽加熱析出所致的渾濁。本法干擾因素少，結果可靠，為目前蛋白定性檢驗中最可信的方法。

1．方法

用150×150mm的試管，加入尿液至2/3高度，加熱煮沸，看有無渾濁，然后加5%醋酸3～4滴，再煮沸，觀察有無渾濁和沉淀。正常為陰性，無渾濁，否則為陽性。

2．評價

本方法較敏感，敏感性為150mg/L，而且干擾因素少。但加熱后出現渾濁既可以是蛋白質也可以是磷酸鹽，故一定要加酸后再煮沸，此時磷酸鹽消失，而蛋白質仍渾濁。另外尿蛋白量少時，加熱后不渾濁而加酸后才渾濁，所以必須嚴格按照加熱→加酸→再加熱的程序。酸不能太少（pH值偏高）也不能太多（pH值偏低），否則會出現假陰性。因在本實驗中白蛋白和球蛋白沉淀的前提條件是尿中有足夠的電解質，對低鹽患者，可因電解質少導致假陰性，此時要先加飽和氯化鈉1～2滴，再進行實驗。

（三）磺基水楊酸法

在酸性環(huán)境下，磺基水楊酸的酸根陰離子與帶正電的蛋白質結合成不溶性蛋白鹽而沉淀。本法操作簡便，靈敏度高，可檢驗多種蛋白，但易造成假陽性。

1．方法

取透明試管，加入尿液3～5ml，加100g/L磺基水楊酸乙醇溶液3～4滴，輕搖試管，1min后觀察結果。正常為陰性，無渾濁，否則為陽性。

2．評價

本方法更為敏感，敏感性為＜100mg/L，除與白蛋白、球蛋白發(fā)生反應外，還與本周蛋白、血紅蛋白反應。但當尿中存在較多的尿酸（鹽）或草酸鹽時也可假陽性（為蛛絲狀渾濁），使用某些藥物如青霉素、碘劑也可造成假陽性，但加熱后消失，借此可鑒別。本方法影響因素較多，難于指導治療。

二、尿蛋白的定量分析

當尿蛋白的篩查實驗為陽性時，則應做定量實驗，長期以來，24小時尿蛋白定量（24hUp）一直做為定量的經典方法。但這種標本的留取很麻煩，不僅要準確留取并測量尿量，而且還要提前添加防腐劑。

（一）雙縮脲法

以磷鎢酸乙醇液沉淀蛋白質，后者在堿性介質中與Cu^＋＋作用，形成紫色洛合物，經與標準管比色即可算出蛋白的含量。

（二）考馬斯亮藍法

在酸性介質中考馬斯亮藍G-250與尿蛋白的NH3＋基團結合，發(fā)生顏色改變，經與標準管比色即可算出蛋白的含量。

三、尿蛋白/尿肌酐（urinary protein/creatatine，P/C，單位g/g．cr）

由于24hUp在留取標本時繁瑣費時實在不方便，而且尿蛋白濃度隨著尿量增減變動很大，不能準確反映真實的尿蛋白情況。近些年一些學者，包括美國K/DOQI指南，建議采納隨機尿或晨尿并用尿肌酐來校正代替24小時蛋白定量，并經臨床實驗證明：P/C與24hUp之間有著良好的相關性和回歸關系。我國著名學者王海燕教授等對此也進行了大量的實驗，并提出兩種留尿方法。

（一）方法

1．晨尿P/C

晨尿可以減少活動帶來的影響，且為濃縮尿，容易陽性，是首推的留尿方法。其中蛋白測定推薦為雙縮尿法，尿肌酐采用堿性苦味酸動力學法。

2．隨機尿P/C

此尿標本受活動影響，同一患者采取兩種方法留尿，會出現結果明顯高于晨尿的差異，這與活動后尿蛋白增加有關。因此，在有條件的情況下，還是以晨尿標本為佳。

（二）評價

盡管該方法得到了國內外的一致認可，并得到了美國K/DOQI指南的推薦，但目前就其診斷界點（正常值）還沒有一個統(tǒng)一。我國王海燕則認為：當Ccr＞10ml/min時，無論是晨尿的P/C還是隨意尿的P/C，都與24hUp高度相關，但Ccr＜10ml/min時，不能使用P/C代替24hUp。用ROC的分析方法，24hUp分別為1g、3g時，P/C的相應值在特異性和敏感性為最佳時，其診斷界點為0．94g/g．cr和2．84g/g．cr。但最終還需要多中心、大規(guī)模的研究。

四、尿蛋白的定性分析（定位診斷）

尿蛋白性質分析有2個含義，一個是鑒定尿中蛋白的成分是何種蛋白（如白蛋白）或是以何種蛋白為主（如β2-M），以此來進行定位診斷（如腎小球/腎小管）或特殊疾病的診斷（如多發(fā)性骨髓瘤），二是在非顯性蛋白尿（常規(guī)檢查陰性）的情況下，對尿蛋白進行微量（在μg或μμg的水平上）分析，以便對某些疾病做出早期診斷，如尿微量白蛋白對糖尿病腎病和高血壓腎病的早期診斷有重要的意義（見圖2-16）。

圖2-16　尿蛋白的分類與定位關系

（一）腎小球性蛋白尿

腎小球性蛋白尿是指腎小球基底膜電荷屏障或和分子屏障受到損傷，使尿蛋白“漏”出過多，超過了腎小管的再吸收能力，引起的蛋白尿。其特點是以中分子以上的蛋白為主，白蛋白做為其特征，蛋白量不等，但多＞＋＋或＞1g/24h。

1．白蛋白（albumin，Alb）/微量白蛋白（microalbumin，mAlb）

白蛋白是由肝臟細胞合成的，為含585個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量66458，半衰期15～19天。是血漿中含量最多的蛋白，占總蛋白的40～60%。正常腎小球基底膜的濾孔直徑為5．5nm，而白蛋白的直徑為7．2nm，且?guī)ж撾?，所以難于通過腎小球，故正常尿中僅含有微量。尿中出現白蛋白是腎小球損傷的重要標志，而出現微量白蛋白（mAlb，指常規(guī)尿蛋白定性陰性的情況下，常需要用其他的方法檢測）則是腎小球早期損傷的敏感指標，是糖尿病、高血壓損傷腎小球最早出現的改變，目前多采用兩種方式做為標準化，一是24小時尿總白蛋白（＞30mg為界點），另一個是白蛋白排泄率（＞20μg/min為界點）。但目前的主要問題是mAlb的測定及應用要進一步規(guī)范化，美國糖尿病協會（ADA）建議mAlb的診斷不能只憑一次結果，而要連續(xù)檢測3次（每3～6個月1次），而其中至少有2次明顯升高。另外對標本的采集和報告單位也要有一個明確的、統(tǒng)一的規(guī)定：標本要留取24小時尿，如采用一次尿（spot urine）則要求用尿白蛋白/肌酐比值（albumin/creatinine ratio，ACR）法，單位用μg/mg或mg/g才能做為診斷依據。

2．轉鐵蛋白（transferrin，TRF）

是另一項腎小球損傷的標志物，但其利用率不及mAlb。主要在肝細胞合成，為單鏈糖蛋白，分子量77KD，半衰期7天。是血漿中主要的含鐵蛋白質。負責運載由消化道吸收的鐵和由紅細胞破壞釋放的鐵進入到骨髓，供紅細胞生成。血中的TRF主要用于貧血的診斷。在急性炎癥、肝功能障礙、營養(yǎng)不良、大量蛋白丟失等，都可以使其下降。尿中TRF增高，也是腎小球病變的特征，主要反映電荷屏障的損害。由于TRF的等電點較白蛋白高，帶有較少負電荷，而腎小球濾過膜富含的HSPG和唾液酸帶有大量的負電荷，當TRF通過濾過膜時，受到的電荷排斥力較白蛋白小，故它較后者更容易漏出，因而能更敏感地反映腎小球電荷屏障的受損。

3．免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）

是血中5種Ig中含量最多的，分子量160KD，也是在尿中唯一能測到的Ig，因分子量大，正常時，腎小球不能濾過，只有當腎小球發(fā)生病變時，尿中才會出現，主要反映了分子屏障的損害。因尿IgG排出總是比尿Alb晚，所以它反映腎臟病變的加劇，表示腎小球功能受到較嚴重的損害，是非選擇性蛋白尿的標志。但尿路的粘膜也會分泌極少量的IgG，所以，一些尿路的損傷、炎癥，也會使IgG輕度增高，在分析時，應加以判斷。

（二）腎小管性蛋白尿

腎小管性蛋白尿是指由于各種原因導致的腎小管重吸收障礙，不能將腎小球濾過的蛋白進行重吸收，從而導致的尿蛋白。腎小管損傷的特征是以小分子為主的蛋白，占70%以上，而白蛋白只占20%左右。代表腎小管損傷的主要標志物有兩大類，一類是小分子量的蛋白，一類是尿酶。前者主要包括：β2-微球蛋白、α₁-微球蛋白、視黃醇結合蛋白，后者主要是尿NAG酶。腎小管性蛋白尿的特點是：量相對較少，蛋白定量常＜＋＋或＜1g/24h，其臨床意義主要見于①急性腎損傷（急性腎小管壞死、急性間質性腎炎）；②小管-間質疾病（如Batter綜合征、范可尼綜合征）；③鑒別上/下尿路感染（上尿路感染時增高，動態(tài)觀察還可判定療效）；④一些疾病對小管的早期損害（糖尿病、高血壓）（見表2-28）。

表2-28　幾種常見的尿蛋白臨床意義

1．β2-微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）

是有核細胞產生的，并存在于細胞表面，是HLA的一部分。它含100個氨基酸和1個二巰鍵的單鏈多肽，分子量11800。β2-MG能正常通過腎小球濾過膜，但幾乎被近曲小管以胞飲的方式攝取，在細胞內分解為氨基酸，再返回血液。近曲小管是β2-MG降解的唯一場所，因此，一旦腎小管損傷便不能重吸收，尿中就會出現該蛋白。由于尿中的β2-MG在pH＜5．2以下時，極易分解，所以在留取標本時應該特別注意，要么立即測定，要么調節(jié)pH6．5～7．0暫時保存，否則會影響結果的判定。

2．α₁-微球蛋白（α₁-microglobulin，α₁-M）

主要在淋巴細胞和肝臟中產生，廣泛分布于人體各種體液中及淋巴細胞膜表面，是由167個氨基酸組成的糖蛋白，分子量27000，它與人類白細胞抗原HLA-ALL、HLA-B20、HLA-BWS1等抗原決定簇有交叉反應。血液中的α₁-M分游離型和與IgA結合的兩種形式。正常情況下，可自由通過腎小球濾過膜的是游離型α₁-M，并在近曲小管幾乎全部重吸收并分解代謝。近年來α₁-M在腎功能的監(jiān)測作用逐漸受到重視，當腎小管受損時，尿中α₁-M首先增加，比尿中β2-MG敏感，這是由于腎小管對α₁-M的重吸收障礙先于β2-MG，尿α₁-M不受尿液酸堿度影響，與其它低分子蛋白相比是較好的反映腎小管受損的早期靈敏指標。

3．視黃醇結合蛋白（Retinol-BindingProtein，RBP）

是血液中視黃醇（維生素A）的轉運蛋白，它是由肝臟合成的一種低分子量蛋白，RBP分子由一條多肽鏈及小部分碳水化合物組成，不含中性糖及氨基己糖，分子量為21KD，等電點pH4．4～4．8，半衰期3～12小時。廣泛分布于人體血清、腦脊液、尿液及其他體液中，主要功能是將視黃醇從肝細胞轉運到周圍組織的上皮細胞，血漿中的RBP與視黃醇、前白蛋白以1∶1∶1（mol）的復合物形式存在，形成高分子蛋白復合物，此復合物可降低RBP在腎臟的分解及腎小球的濾過。但當視黃醇被轉運到靶細胞后，RBP便游離到血漿中，迅速被腎小球濾過，幾乎全部被腎小管上皮細胞重吸收，并被分解供組織利用，僅有少量從尿中排出。RBP在尿中穩(wěn)定性強，不易分解，不受pH值干擾。RBP排量增加可作為腎近曲小管損傷的標志物。

4．尿酶（見腎小管功能檢查）

5．評價

上述的有關腎小球和腎小管的檢查，對早期診斷和定位診斷都有重要的意義，被稱做為腎損傷早期檢測體系（Early　Detection Sysem for Renal in juries），但需要規(guī)范化。各單位可以結合本單位實驗室的具體情況和習慣，可單獨做也可選擇性的組合，其原則是代表腎小球中的蛋白，至少選擇2個，一個是中分子的白蛋白，另一個選擇大分子的蛋白，多選IgG。代表腎小管的蛋白，一般選擇2個即可。按目前的認識，β2-MG因在尿中不穩(wěn)定，已逐漸被Cystatin　C和α₁-M所取代。由于腎小管損傷的標志物受生理因素（尿量、運動）影響，理論上測定24小時尿可以消除這種影響，但可操作性差，為此，現在國際上通行的準則是用留取任一次尿標本做檢測的同時用尿肌酐比值（待測物質量/肌酐）來校正。這其中包括mAlb、Cystatin　C、α₁-M和β2-MG。

（三）溢出性蛋白尿

是指腎小球濾過和腎小管的重吸收功能均正常情況下，由于血中某種小分子的蛋白濃度過高，經正常（或異常？）的腎小球濾出，超過腎小管的重吸收能力引起的蛋白尿稱為溢出性蛋白尿。臨床上最常見的是免疫球蛋白的輕鏈。

1．輕鏈（light chain）

是免疫球蛋白（Ig）的組成部分。正常人Ig含有2個重鏈和2個輕鏈。與IgA、IgG、IgM、IgD、IgE相對應的重鏈分別是γ、α、μ、δ和ε，輕鏈則僅含κ（kappa）和λ（Lambda），在1個Ig中，兩個輕鏈的比接近2∶1，游離輕鏈也叫本-周蛋白（bence Jones），又因該蛋白在40～60℃凝固，溫度上升到90～100℃再次溶解，所以又叫凝溶蛋白。輕鏈的分子量為22000，以單體或二聚體形式存在。輕鏈由漿細胞產生，正常情況下，輕鏈和重鏈的分泌是平衡的，二者結合成完整的免疫球蛋白。輕鏈κ和λ的基因分別在2號和22號染色體上，正常合成一個分子的Ig（2輕2重）需要36min，其中1條輕鏈10min，而1條重鏈則需要18min，組成1條完整的Ig就要有1條以上的輕鏈過剩。當有增殖性疾病時，合成速度明顯加快，此時合成一個分子的Ig（2輕2重）只需要5min，其中1條輕鏈1min，而1條重鏈僅需要2．5min，同樣會造成輕鏈的過剩。無論是正常還是異常的過剩輕鏈，都由B細胞分泌到胞外，腎臟是游離輕鏈清除的唯一器官，正常情況下，輕鏈能自由通過腎小球的基底膜，但在腎小管90%重吸收，10%隨尿排出，故尿中僅有微量的輕鏈。正常尿中＜4μg/ml或＜2mg/24h，且κ/λ為2∶1。對于人類κ和λ的比值是固定的，κ-Ig占66%，λ-Ig占34%，這個比例可以做為單克隆和多克隆Ig增殖的鑒別。

（1）臨床意義

①單克隆或惡性漿細胞?。簡我惠p鏈大量合成，所產生的Ig是同質的，尿中有大量過剩的游離輕鏈，即B-J蛋白。此輕鏈是κ或λ，因此造成κ/λ的非正常比例（2∶1），使比例變?yōu)椋?∶1或＜2∶1。同時血漿中有單克隆增殖的M蛋白。如多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性淀粉樣變、輕鏈病、惡性淋巴瘤。

②多克隆增殖：多克隆Ig增殖，過剩的輕鏈大量出現在尿中，可達200μg/ml，一般方法就可測出，但κ/λ仍為2∶1。多見于繼發(fā)性疾病，如SLE、慢性感染、急慢性肝炎、肝硬化等。

③輕鏈?。耗蛑械妮p鏈屬于單克隆，含量大，血中不增加，無M蛋白，甚至低于正常。也有人認為是多發(fā)性骨髓瘤的特殊類型或流產型。

④某些疾病的早期腎臟損害指標：高血壓、糖尿病。

⑤某些腎臟?。河袌蟮涝诟黝惸I臟病中κ陽性率為41%，而λ陽性率為16．2%，其中以腎病綜合征的陽性率和含量最高，以κ為主，可為正常人的5倍。

（2）評價。

正常和疾病時，血和尿中都存在微量的游離輕鏈，用一般的方法是無法測出的，用RIA或ELA，可以檢測到微量的水平。結合到Ig分子上的兩條輕鏈，雖然與重鏈以二巰鍵結合成大分子，但用抗輕鏈抗體仍能測到它的存在，以此可以區(qū)別κ和λ型Ig，即結合輕鏈，結合輕鏈的檢查對診斷和鑒別診斷Ig增殖病的性質有重要意義。尿中有輕鏈并不等于就是B-J蛋白陽性，更不等于就是輕鏈病。

2．肌紅蛋白

詳見急性腎衰一章中有關腎小管壞死的相關內容。