第九章　免疫學(xué)檢測法

學(xué)習(xí)目標(biāo)

1．熟悉抗原抗體反應(yīng)的特點和影響因素。

2．了解免疫學(xué)檢測常用方法。

免疫學(xué)檢測技術(shù)的用途非常廣泛，可用于有關(guān)免疫疾病的診斷、療效評價及發(fā)病機制的研究。此外免疫學(xué)檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中對抗原性物質(zhì)或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學(xué)現(xiàn)象的研究，而且擴大了免疫學(xué)與醫(yī)學(xué)生物學(xué)許多領(lǐng)域的聯(lián)系。本章僅介紹常用免疫學(xué)檢測方法的原理和應(yīng)用。

第一節(jié)　抗原或抗體的體外檢測

抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性。在一定條件下，二者結(jié)合可出現(xiàn)肉眼可見或儀器可檢測到的反應(yīng)，據(jù)此，在體外可用已知的抗原(或抗體)來檢測相應(yīng)未知的抗體(或抗原)?？贵w主要存在于血清中，因此，體外的抗原抗體反應(yīng)又稱為血清學(xué)反應(yīng)。

一、抗原抗體反應(yīng)的特點

(一)特異性

一種抗原一般僅能與它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原抗體反應(yīng)的專一性即特異性?？乖贵w的結(jié)合就像酶與底物的結(jié)合，激素與其受體的結(jié)合一樣不是化學(xué)的反應(yīng)，而是非共價鍵的可逆結(jié)合?？乖砦缓涂贵w分子可變區(qū)構(gòu)型的互補，造成兩分子間有較強的親和力。空間構(gòu)型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結(jié)合力強弱也不同?；パa程度高，則親和力強。

天然抗原分子通常具有多種抗原表位，可刺激機體產(chǎn)生多種特異性抗體。若兩種不同的抗原分子具有一種或多種相同的抗原表位，則二者均能與對方抗血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合，即發(fā)生交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)可影響血清學(xué)診斷的準確性。采用單克隆抗體進行檢測是克服交叉反應(yīng)的有效方法之一。

(二)可逆性

抗原與相應(yīng)抗體除空間構(gòu)型具有互補性外，兩者主要是通過分子表面的氫鍵、疏水鍵、靜電引力和范得華力非共價結(jié)合。非共價結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物不穩(wěn)定，降低溶液的pH或提高溶液離子強度均可使抗原抗體復(fù)合物解離，即抗原抗體反應(yīng)具有可逆性。解離后的抗原和抗體仍能保持原有的理化特性和生物學(xué)活性。據(jù)此，可通過親和層析法純化抗原或抗體。

(三)可見性

抗原與抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)取決于二者的濃度和比例。在一定濃度范圍內(nèi)，二者比例合適，即抗原略多于抗體時，可出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)物(即由網(wǎng)絡(luò)狀抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀物或凝集物);若二者比例不合適，即抗原或抗體過剩時，可形成小分子抗原－抗體復(fù)合物。此種復(fù)合物多呈游離狀態(tài)，不能為肉眼所見。據(jù)此在實驗過程中，應(yīng)注意調(diào)整反應(yīng)體系中抗原和抗體的比例，以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

(四)階段性

抗原抗體反應(yīng)分為兩個階段:第一階段是抗原抗體特異性結(jié)合階段，其特點是反應(yīng)快，可在數(shù)秒鐘至數(shù)分鐘內(nèi)完成，一般不能被肉眼所見;第二階段是可見反應(yīng)階段，根據(jù)參加反應(yīng)的抗原物理性狀的不同，可出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象。可見反應(yīng)階段所需時間較長，從數(shù)分鐘、數(shù)小時至數(shù)日不等，且受電解質(zhì)、溫度和酸堿度等因素影響。

二、抗原抗體反應(yīng)的影響因素

1．電解質(zhì)　抗原和抗體具有膠體性質(zhì)，在中性或弱堿性條件下有較高的親水性。當(dāng)抗原與抗體結(jié)合后，其親水性減弱，在電解質(zhì)作用下，抗原抗體復(fù)合物失去較多負電荷，從而使之彼此連接出現(xiàn)肉眼可見的凝集或沉淀現(xiàn)象。試驗中常用0．85%的NaCl溶液作為稀釋液，以提供適當(dāng)濃度的電解質(zhì)。

2．溫度　提高溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機會，加速抗原抗體復(fù)合物的形成。但溫度過高(50℃以上)可使抗原或抗體變性失活，影響實驗結(jié)果。通?？乖贵w反應(yīng)的最適溫度是37℃。

3．酸堿度　抗原抗體反應(yīng)的最適pH值在6～8之間，pH值過高或過低，即過堿或過酸，均可影響抗原或抗體的理化性狀。例如，當(dāng)反應(yīng)液中的pH值接近抗原的等電點時，可因抗原自沉而出現(xiàn)非特異性酸凝集，這種凝集現(xiàn)象并不是顆粒性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合的結(jié)果，嚴重影響試驗的可靠性。

三、抗原抗體反應(yīng)的類型和檢測方法

根據(jù)抗原的性質(zhì)、參與反應(yīng)的成分和反應(yīng)呈現(xiàn)的結(jié)果，可將抗原抗體反應(yīng)分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)和采用標(biāo)記物進行的抗原抗體反應(yīng)。

(一)沉淀反應(yīng)

可溶性抗原與抗體結(jié)合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復(fù)合物。在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)(precipitation reaction)。沉淀反應(yīng)可在液體中，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。在液體中進行的沉淀反應(yīng)如絮狀沉淀反應(yīng)等，由于其操作復(fù)雜、敏感性差已被目前所用的免疫比濁法取代。沉淀反應(yīng)大多在半固體瓊脂凝膠中進行，使可溶性抗原或抗體在凝膠中擴散，在比例合適處相遇形成肉眼可見的白色沉淀現(xiàn)象。瓊脂擴散試驗包括單項瓊脂擴散和雙向瓊脂擴散。此外，將瓊脂擴散與電泳技術(shù)結(jié)合，又可衍生出對流電泳、火箭電泳和免疫電泳等多種檢測方法。

1．單向瓊脂擴散試驗　是在凝膠中進行的沉淀反應(yīng)。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，抗原與瓊脂中的相應(yīng)抗體相遇，可在比例適宜處形成以孔為中心的白色沉淀環(huán)，鑒于其直徑與加入的抗原濃度成正比，所以常用于定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，本方法簡便，結(jié)果易觀察，其缺點是需1～2天才能看結(jié)果。

2．免疫比濁法　當(dāng)抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復(fù)合物，它可使通過液體的光束發(fā)生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復(fù)合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應(yīng)加強。免疫比濁法就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經(jīng)過一段時間，用光散射濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

3．雙向瓊脂擴散試驗　是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。

4．對流免疫電泳　是一種敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向瓊脂擴散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1 h左右即可觀察結(jié)果。

5．免疫電泳　免疫電泳的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當(dāng)?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有針對各種抗原的混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進行雙向瓊脂擴散，可形成多條沉淀線。常用此法進行血清的蛋白種類分析，對于免疫球蛋白缺損或增多的等疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義。

6．免疫印跡法　免疫印跡法為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據(jù)分子量大小不同，病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，再用酶標(biāo)記免疫、放射免疫等技術(shù)進行檢測。該法能對分子大小不同的蛋白質(zhì)進行分離并確定其分子量和抗原特性，常用于病毒抗體或抗原的檢測及目的基因表達產(chǎn)物的鑒定。

(二)凝集反應(yīng)

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?dāng)與相應(yīng)抗體結(jié)合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(yīng)(agglutination)。

1．直接凝集反應(yīng)　是細菌或紅細胞與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象，可用于傳染病診斷，如肥達反應(yīng)(Widal reaction)，或利用血細胞凝集現(xiàn)象檢查血型。

2．間接凝集反應(yīng)　是用可溶性抗原或抗體與免疫無關(guān)的載體顆粒(如膠乳顆?；蚣t細胞)結(jié)合形成致敏顆粒后，再與相應(yīng)抗體或抗原進行反應(yīng)出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。將人IgG包被乳膠顆粒檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中的類風(fēng)濕因子;用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用于檢測甲狀腺球蛋白的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標(biāo)本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳膠顆粒，一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混合，便可發(fā)生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應(yīng)既可測定抗原，又可測定抗體，方法簡便、敏感。

3．間接凝集抑制試驗　是由間接凝集反應(yīng)衍生而來。將待測可溶性抗原與相應(yīng)抗體先行混合作用一定時間后，再加入相應(yīng)抗原致敏的顆粒懸液，若待測抗原與抗體結(jié)合，則反應(yīng)液中游離抗體不復(fù)存在，加入相應(yīng)致敏顆粒就不會出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。臨床上常用此法進行妊娠診斷。

4．抗球蛋白試驗　抗球蛋白試驗(antiglobulin test，coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如，診斷自身免疫溶血性貧血癥時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應(yīng)。因抗Rh抗體是IgG，只有兩個結(jié)合價，分子較小(不如IgM結(jié)合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG凝集紅細胞，提高凝集反應(yīng)的靈敏度。

(三)補體參與的抗原抗體反應(yīng)

這一類反應(yīng)是利用抗體與紅細胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合后，可使反應(yīng)體系中補體激活，導(dǎo)致紅細胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象而建立的。補體結(jié)合試驗和溶血空斑試驗均為補體參與的實驗。此外，HLA血清學(xué)分型法，即補體依賴的微量細胞毒試驗也是補體參與的反應(yīng)，但本試驗破壞的靶細胞不是紅細胞，而是淋巴細胞。補體結(jié)合試驗曾廣泛用來檢測多種細菌、病毒的抗原或抗體，但因操作復(fù)雜，易受實驗條件影響，目前已被其他方法取代。

(四)免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的一種試驗方法。為提高抗原和抗體檢測的靈敏性，可選用易顯示的物質(zhì)標(biāo)記已知的抗原或抗體，通過檢測標(biāo)記物，間接測定待測抗體或抗原。常用的標(biāo)記物有酶、熒光素、放射性核素、膠體金和鐵蛋白等。

免疫標(biāo)記技術(shù)極大地提高了抗原抗體反應(yīng)的靈敏度，不但能對抗原或抗體進行定性和精確定量測定，而且借助光鏡或電鏡技術(shù)，能夠觀察抗原、抗體或抗原抗體復(fù)合物在組織細胞內(nèi)的分布和定位。

1．酶聯(lián)免疫測定法(enzyme immunoassay，EIA)其為當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測定儀做定量分析，敏感度可達納克水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原;后者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)將抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行，通過洗滌去除未與固相載體結(jié)合的游離成分，加底物顯色進行測定。ELISA檢測方法很多，簡介如下。

夾心法:將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片)上，加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中的抗原即可與載體上的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的材料后加入該抗原的酶標(biāo)記抗體，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。

間接法:常用于檢查特異性抗體。先將已知特異性抗原包被固相載體，加入待檢標(biāo)本(可能含有相應(yīng)抗體)，再加入酶標(biāo)抗Ig的抗體(即第二抗體)，洗滌后再加底物顯色，根據(jù)顏色的光密度計算出標(biāo)本中抗體的含量。

(2)BAS－ELISA　生物素(biotin)是廣泛分布于動植物體內(nèi)的一種生長因子，以輔酶形式參與各種羧化酶反應(yīng)，又稱為輔酶R或維生素H。親和素(avidin)是卵白素和某些微生物中的一種蛋白質(zhì)，由四個亞基單位組成，對生物素有高度親和力。在一定條件下，生物素和親和素均能與抗體、抗原或辣根過氧化酶偶聯(lián)，而不影響其生物學(xué)活性。在生物素－親和素系統(tǒng)(biotin avidin system，BAS)中，利用親和素－生物素－酶三分子復(fù)合物追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。鑒于抗原或抗體可偶聯(lián)多個生物素，而且一個親和素可結(jié)合4個生物素分子，因此本試驗具有放大效應(yīng)，可進一步提高檢測的靈敏度。例如用此法檢測抗原時，可先用已知特異性抗體包被固相，依次加入待測樣品、生物素標(biāo)記的特異性抗體、酶標(biāo)記的親和素、最后加底物顯色。生物素也能結(jié)合核苷酸，因此BAS除用于抗原、抗體檢測外，還可用于DNA和RNA的測定。

(3)酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)　本試驗基本原理是用已知抗細胞因子的抗體包被固相載體(硝酸纖維素膜/PVDF膜)，加入待測細胞孵育一定時間后去除細胞，若待測細胞分泌的細胞因子與包被的抗體相對應(yīng)，即可在細胞周圍形成細胞因子(抗原)－抗體復(fù)合物。然后加入相應(yīng)酶標(biāo)抗細胞因子抗體，并通過底物顯色，即可在分泌相應(yīng)細胞因子的細胞所在處呈現(xiàn)有色斑點。一個斑點表示一個分泌相應(yīng)細胞因子的細胞，通過計數(shù)可推算出分泌某種細胞因子細胞的頻率。實驗結(jié)果需在顯微鏡下觀察，也可用專門儀器(ELISPOT分析系統(tǒng))計數(shù)。酶聯(lián)免疫斑點試驗可直接用于檢測T細胞分泌的單一細胞因子。本試驗若用已知抗原包被相應(yīng)載體，也可用來檢測分泌特異性抗體的B細胞。

(4)酶免疫組化技術(shù)　酶免疫組化技術(shù)(immunohistochemistry technique)是用標(biāo)記的已知抗體與組織或細胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察對抗原進行定性、定位或定量檢測的技術(shù)。常用的免疫組化技術(shù)包括:酶免疫組化(辣根過氧化酶標(biāo)記)、金免疫組化(膠體金顆粒標(biāo)記)，免疫電鏡技術(shù)(鐵蛋白、膠體金、過氧化酶標(biāo)記)等。

2．免疫熒光技術(shù)　免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應(yīng)抗原(或抗體)結(jié)合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法　把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞涂片或組織切片上進行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。

(2)間接熒光法　可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體(不標(biāo)記熒光)結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標(biāo)記的第二抗體，結(jié)果觀察與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢測抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體。

免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體等感染性疾病的檢測，如查出IgM抗體，可作為近期接觸抗原的標(biāo)志。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene－activated cell sorting，F(xiàn)ACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，對同一細胞進行雙標(biāo)記染色，這對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。

3．放射免疫測定法(radioimmunoassay，RIA)應(yīng)用競爭性結(jié)合的原理，用放射性核素標(biāo)記抗原(或抗體)，與相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合，通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，包括液相法和固相法兩種檢測方法，具有敏感性高、重復(fù)性好、準確性高等優(yōu)點，因此常用于激素藥物等微量物質(zhì)的檢測。但放射性核素對人有一定的危害性，且易污染環(huán)境，因此其應(yīng)用受到一定限制。常用的放射性核素有125 I、131 I、3 H、14 C、32 P等。

第二節(jié)　免疫細胞的測定

檢測各群體淋巴細胞的數(shù)量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標(biāo)本。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進行檢查。

一、淋巴細胞的分離與類型鑒定

體外檢測淋巴細胞，首先需制備外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)，常用的方法是葡聚糖－泛影葡胺(又稱淋巴細胞分離液)密度梯度離心法。用該法去除紅細胞、粒細胞等成分后，即為PBMG，分離純度可達95%。若需純化的淋巴細胞，可將PBMC堆于培養(yǎng)皿上，由于單核細胞易吸附玻璃或塑料而貼附于平皿上，收集未貼附的細胞即為富含淋巴細胞的懸液。若要分離T細胞，可用多種方法。如尼龍毛分離，可利用B細胞、單核細胞等能吸附尼龍毛的特性，將PBMC通過尼龍毛柱時B細胞吸附于柱上，T細胞被洗脫分離;應(yīng)用抗CD3單克隆抗體的貼附法及應(yīng)用T細胞表面的CD2能結(jié)合綿羊紅細胞(SRBC)，使其形成花結(jié)(E花結(jié)試驗)，比重增大，用密度梯度離心法將其與其他細胞分離。以下方法通過檢測淋巴細胞的某些表面標(biāo)志，可確定細胞的不同類型的比例。

1．免疫熒光法　常用直接或間接免疫熒光法檢查淋巴細胞的表面標(biāo)志，鑒定細胞的群、亞群。如CD4+和CD8+細胞亞群，表達m IgD、m IgM的B細胞等。

2．磁珠分離法　將已知抗細胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)于稱為微珠(平均直徑小于1．5μm)的磁性顆粒，與細胞懸液反應(yīng)后，磁珠借抗體結(jié)合于相應(yīng)細胞群或亞群表面。再將細胞懸液加于一試管內(nèi)并置磁場中，因磁珠被磁場吸引，將磁珠結(jié)合的細胞與未結(jié)合磁珠的細胞分開。例如，用抗CD4交聯(lián)的磁珠可將T細胞中的CD4+ T細胞與CD8+ T細胞分開，從而獲得高純度的CD4+ T細胞。

3．淘選法　將已知抗細胞表面標(biāo)記的抗體包被培養(yǎng)皿，加入淋巴細胞懸液，表達相應(yīng)表面標(biāo)記的細胞即與相應(yīng)抗體結(jié)合，而貼附于固相上，與懸液中的其他細胞分開。例如，用抗CD4抗體包被培養(yǎng)皿，可將CD4+ T細胞與其他T細胞分開。采用間接法時，則將二抗包被聚苯乙烯培養(yǎng)皿，加入已與一抗結(jié)合的細胞，獲得同樣分離效果，而且在實際工作中更常用。

4．流式細胞術(shù)(flow cytometry)　是借助熒光激活細胞分選器(fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS)對免疫細胞及其他細胞進行快速準確鑒定和分類的技術(shù)。流式細胞儀集光學(xué)、流體力學(xué)、電子學(xué)和計算機技術(shù)一體，對細胞作多參數(shù)定量測定和綜合分析，包括細胞大小、核型、表面分子種類等。將樣品制備成單細胞懸液，經(jīng)一種或多種熒光素標(biāo)記的抗體染色，在壓力作用下細胞排成單列經(jīng)噴嘴噴出，形成細胞液柱。液柱與高速聚焦激光束相交，相交點稱為測量區(qū)，細胞經(jīng)過該區(qū)時產(chǎn)生散射光并散發(fā)熒光，被光電檢測器接收后將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，經(jīng)加工處理存儲于計算機中，再用分析軟件對數(shù)據(jù)作圖像顯示、統(tǒng)計處理，可快速準確獲取結(jié)果。該法可檢測T細胞、B細胞、NK細胞、單核－巨噬細胞、樹突狀細胞等及其比例，CD4/CD8T細胞比值，以及白血病、淋巴瘤的免疫學(xué)分型。此外，可借助光電效應(yīng)，微滴通過電場時出現(xiàn)不同偏向，因此可分類收集所需的細胞群或亞群。該技術(shù)能以每秒約5000～10 000個細胞的速度無菌收集細胞，分選純度在95%以上，而且可保持細胞活性，供進一步研究使用。

5．抗原肽－MHC分子四聚體技術(shù)　四聚體(tetramer)技術(shù)的原理是用生物素化的抗原肽－MHC分子復(fù)合物與熒光標(biāo)記的親合素結(jié)合，由于1個熒光素標(biāo)記的親合素可結(jié)合4個生物素分子，能使4個MHC/抗原肽復(fù)合物形成一個復(fù)合體，將該復(fù)合體標(biāo)記熒光素后，即成抗原特異性四聚體?？乖禺愋运木垠w能與樣品中的特異性T細胞的TCR結(jié)合，由于四聚體能同時結(jié)合一個T細胞表面的4個TCR，親和力大大提高。用流式細胞術(shù)即可確定待檢標(biāo)本中抗原特異性CTL細胞的頻率。MHC分子可為Ⅰ類或Ⅱ類分子，與抗原肽形成四聚體復(fù)合物，可分別鑒定表達特異性TCR的CD8+ T細胞及CD4+ T細胞的頻率。

二、免疫細胞功能測定

細胞免疫涉及多種免疫細胞的相互作用和多種細胞因子的參與，功能測定的指標(biāo)體系復(fù)雜，方法不易標(biāo)準化。

(一)T細胞功能測定

1．T細胞增殖試驗　植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白(Con A)等絲裂原以及抗CD3單克隆抗體等能非特異地活化培養(yǎng)的T細胞，并使其增殖。在增殖過程中細胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，細胞形態(tài)改變，最終細胞分裂。

(1)3 H－TdR摻入法　在PBMC中加入PHA共同培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前8～15 h加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3 H－TdR)，由于3 H－TdR能摻入細胞合成的DNA中，細胞增殖水平越高，摻入的放射性核素越多。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，用液體閃爍儀測定樣品的放射活性，反映細胞的增殖狀況。該法靈敏可靠，應(yīng)用廣泛，但需特殊儀器，易有放射性污染。

(2)MTT法　MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3－(4，5－二甲基－2－噻唑)－2，5－二苯基溴化噻唑。在細胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入的MTT，作為細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的底物參與反應(yīng)，形成紫藍色的甲　顆粒并沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍。甲　可被隨后加入的鹽酸異丙醇或二甲基亞砜完全溶解，可用酶標(biāo)測定儀測定細胞培養(yǎng)物的OD值。因甲

的生成量與細胞增殖水平正相關(guān)，故OD值反映細胞增殖水平的高低。該法也用于某些細胞因子活性的測定(細胞因子依賴的細胞株增殖法)。MTT法敏感性雖不及3 HTdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。

T細胞增殖試驗也可檢測特異抗原致敏的T細胞，在培養(yǎng)細胞中加入特異性抗原，則只有該抗原特異的T細胞發(fā)生增殖反應(yīng)，從而反映機體特異的細胞免疫功能。

2．細胞毒試驗　CTL、NK細胞對靶細胞有直接殺傷作用，可根據(jù)待檢效應(yīng)細胞的性質(zhì)，選用相應(yīng)的靶細胞，如腫瘤細胞、移植供體細胞等。該試驗用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)、病毒感染等方面的研究。

(1)51 Cr釋放法　用 標(biāo)記靶細胞，若待檢效應(yīng)細胞能殺傷靶細胞，則51 Cr從靶細胞內(nèi)釋出。以γ計數(shù)儀測定釋出的51 Cr放射活性，靶細胞溶解破壞越多，51 Cr釋放越多，上清液的放射活性越高。應(yīng)用公式可計算出待檢細胞的殺傷活性。

(2)乳酸脫氫酶釋放法　將效應(yīng)細胞與靶細胞按比例混合，靶細胞被殺傷后細胞膜受損，釋放出乳酸脫氫酶，用光度計測定溶液中該酶的含量，反映效應(yīng)細胞的殺傷活性。

(3)凋亡細胞檢查法　靶細胞被細胞毒性細胞殺傷后，可發(fā)生細胞凋亡，DNA廣泛斷裂，檢查靶細胞凋亡有多種方法。①瓊脂糖電泳法:因凋亡細胞DNA被核酸酶在核小體單位之間隨機切斷，產(chǎn)生180～200 bp(核小體單位長度)及其倍數(shù)的寡核苷酸片斷，在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)階梯狀DNA區(qū)帶圖譜，借此可反映細胞凋亡。②TUNEL法:在細胞培養(yǎng)物中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT)和生物素標(biāo)記的核苷酸，TdT能在游離的DNA3端缺口連接上標(biāo)記的核苷酸，利用親和素－生物素－酶放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，從而指示凋亡細胞。正常細胞無DNA斷裂，則不顯色。將待檢細胞和靶細胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后取培養(yǎng)物涂片，加入TdT和其他試劑，光鏡下檢查計數(shù)凋亡細胞，反映待檢細胞的殺傷活性。該法所用標(biāo)記核苷酸多為dUTP，故稱TUNEL法(TdTmediated dUTP－biotin nick end labeling)。③流式細胞術(shù):凋亡細胞因核斷裂，呈亞二倍體，用FACS分析亞二倍體數(shù)目，指示細胞凋亡程度;因凋亡細胞的細胞膜受損，膜磷脂成分暴露，可與熒光標(biāo)記的膜聯(lián)合蛋白(annexing V)結(jié)合，用FACS分析，可檢測懸浮細胞中凋亡細胞的頻率。

3．細胞因子檢測　細胞因子的檢測有助于了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，鑒定分離的淋巴細胞，監(jiān)測某些疾病狀態(tài)的細胞免疫功能。例如，根據(jù)培養(yǎng)的CD4+細胞分泌的細胞因子確定細胞亞群，產(chǎn)生IL－12、IFN－γ者為Th1，產(chǎn)生IL－4、IL－10者為Th2;艾滋病患者IL－2水平明顯降低，而類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、移植排斥反應(yīng)等患者則升高。細胞因子的檢測方法可分以下三種。

(1)免疫學(xué)檢測法　如用細胞因子單隆抗體包被固相的雙抗體夾心法或ELISPOT測定法。亦可用熒光素標(biāo)記細胞因子抗體，對細胞內(nèi)細胞因子作染色，直接用FACS分析法測定產(chǎn)生該細胞因子的細胞比例。

(2)生物活性測定法　可根據(jù)細胞因子的生物學(xué)活性，選用相應(yīng)的實驗系統(tǒng)，包括細胞增殖法、直接殺傷法、保護細胞免受病毒致病變法等。如選用細胞因子依賴的細胞株，其增殖反應(yīng)水平與細胞因子的含量成正相關(guān)，根據(jù)細胞株的增殖水平可確定樣品中細胞因子的含量。如IL－1、IL－2、IL－4、IL－6的檢測。

(3)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)根據(jù)編碼細胞因子的核酸序列，設(shè)計特定細胞因子cDNA的引物，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR測定待檢細胞中特異的mRNA。該法可用于多種細胞因子的測定。

4．皮膚試驗　正常機體建立了對某種抗原的細胞免疫后，用相同抗原作皮膚試驗時即出現(xiàn)以局部紅腫為特征的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，而細胞免疫低下者則呈陰性反應(yīng)。皮膚試驗方法簡便，可幫助診斷某些病原微生物感染(結(jié)核桿菌、麻風(fēng)桿菌)、免疫缺陷病等，以及疫功接種后的免疫效果(如卡介苗)。皮膚試驗常用的生物性抗原常從病原體中提取，如結(jié)核菌素、麻風(fēng)菌素、鏈激酶一鏈道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。

(二)B細胞功能測定

B細胞介導(dǎo)體液免疫，檢查B細胞的數(shù)量與功能是確定體液免疫正常與否的重要手段之一。原發(fā)性體液免疫缺陷可由B細胞缺失、B細胞分化障礙以及T細胞缺陷所致。在診斷原發(fā)性體液免疫缺陷時除檢查血清Ig外，B細胞的檢查可確定缺陷的原因。

1．B細胞增殖試驗　B細胞受絲裂原刺激后，進行分裂增殖，溫育一定時間后檢查抗體形成細胞的數(shù)目。小鼠B細胞可用細菌脂多糖為刺激物，人則用含有金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的金黃色葡萄球菌菌體及抗IgM抗體刺激。

2．抗體形成細胞測定常用溶血空斑試驗(hemolytic plaque assay)，即測定對SRBC上的抗原產(chǎn)生的抗體形成細胞數(shù)目。其基本原理是抗體形成細胞分泌的Ig與SRBC上的抗原結(jié)合，在補體參與下出現(xiàn)溶血反應(yīng)。方法是將SRBC或吸附有已知抗原的SRBC、待檢的B細胞、補體及適量瓊脂糖液混合，傾注平皿，溫育1～3 h后，肉眼可見有分散的溶血空斑出現(xiàn)，每一空斑中央含一個抗體形成細胞，空斑的數(shù)量即為抗體形成細胞數(shù)。此外，也可用ELISPOT法檢查特異抗體形成細胞。

(三)吞噬細胞功能測定

吞噬細胞包括中性粒細胞和巨噬細胞，人吞噬細胞功能試驗常用中性粒細胞。用外周血單個核細胞分離的方法，收集紅細胞上層即為中性粒細胞。

1．趨化功能測定　中性粒細胞在趨化因子(如補體產(chǎn)物、趨化性細胞因子等)作用下可定向運動，通過觀察中性粒細胞的運動情況可判定結(jié)果。

(1)Boyden小室法　由上下兩室組成，室間隔以8μm的微孔濾膜，將檢測細胞置于上室，趨化因子置于下室。細胞沉降至濾膜上，如受趨化因子吸引，細胞則可通過微孔爬行于濾膜趨化因子側(cè)的面上，將濾膜取下，染色、細胞計數(shù)，即可知細胞趨化的情況。本法除用于吞噬細胞趨化外，還可用于淋巴細胞和其他細胞的趨化功能測定。

(2)瓊脂糖凝膠法　制備瓊脂糖凝膠板，用打孔器打3個孔，中央孔加粒細胞懸液，兩側(cè)孔分別加趨化因子和生理鹽水對照，經(jīng)數(shù)小時溫育后用戊二醛固定，移去瓊脂糖，對黏附在玻片上的細胞染色，觀察被檢細胞的趨化程度。

(3)過氧化物酶測定法　采用濾膜滲透法。當(dāng)中性粒細胞向含趨化因子的培養(yǎng)小室運動后終止培養(yǎng)，因中性粒細胞內(nèi)含有過氧化物酶，溶解細胞后，加入該酶的底物二甲氧基苯胺，405 nm波長比色，測定培養(yǎng)小室中的過氧化物酶含量，以反映中性粒細胞的趨化活性。

2．吞噬功能測定

(1)硝基藍四氮唑試驗　在抗凝全血或白細胞懸液中加入硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazoli－um NBT)溶液，由于中性粒細胞在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物(ROI)，其中超氧陰離子 能使被吞噬進細胞內(nèi)的NBT還原成不溶解的暗藍色甲　，沉積于細胞漿中，稱NBT陽性細胞。光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞，其百分率可反映中性粒細胞的殺傷功能。

(2)熒光標(biāo)記物試驗　將熒光素標(biāo)記的生物顆粒(如大腸桿菌、白色念珠菌等)與白細胞懸液混合，溫育一定時間后加入臺盼藍并洗滌，以去除被吞噬的熒光顆粒，離心收集細胞，重懸后用熒光分光光度計定量分析。

(靳　靜)