人參皂苷與川芎嗪合用對家兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

隨著溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)等新技術(shù)的廣泛開展,心肌IR損傷日益成為科研的熱點(diǎn)。近年來發(fā)現(xiàn)其與血清腫瘤壞死因子α( TNFα)、一氧化氮(NO)之間存在著密切聯(lián)系。本課題著重考察人參皂甙(GS)和川芎嗪(TMP)合用對心肌IR損傷的保護(hù)作用及其對IR期間TNFα和NO釋放的影響。

一、材料與方法

(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取健康雄性成年家兔35只,體重為2.5kg±0.5kg。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為5組:①模型對照組,簡稱Model組(0.9%NS5ml,iv),n=7;②維拉帕米(德國基諾藥廠巴斯夫中國有限公司產(chǎn)品,5mg/2ml,批號970115)治療對照組,簡稱Ver.組(0.25mg/kg,iv),n=7;③川芎嗪(無錫市第七制藥廠產(chǎn)品,40mg/2ml,批號970418)治療對照組,簡稱TMP組(40mg/kg,iv),n=7;④人參皂甙(安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供,2g/10ml,批號97040)治療對照組,簡稱GS組(0.2g/ kg,iv),n=7;⑤人參皂苷與川芎嗪合用治療組,簡稱GS+TMP組(0.2g/kg和40mg/kg依次iv),n=7。

(二)實(shí)驗(yàn)過程

1.步驟 家兔稱重后依次經(jīng)耳緣靜脈注射20%烏拉坦溶液(1g/ kg)、肝素鈉溶液(500U/kg)進(jìn)行麻醉與抗凝,然后固定于手術(shù)臺上,取仰臥位,接上ECG電極(標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)),與RM86型八道生理記錄儀相通。一個(gè)6F心導(dǎo)管(注入肝素溶液)插入左側(cè)股靜脈供藥物注射使用;7F心導(dǎo)管(注入肝素溶液)經(jīng)右側(cè)頸靜脈插至冠狀靜脈竇處,供取血用;另一個(gè)6F心導(dǎo)管(注入肝素溶液,經(jīng)3路開關(guān)接壓力換能器,再通過載波放大器與RM86型八道生理記錄儀相通)沿左側(cè)頸總動(dòng)脈插入左心室,監(jiān)測與記錄左心室內(nèi)壓(LVP)波形和左室內(nèi)壓變化速率(±dp/dt)波形。

2.心肌

IR模型制作 剪毛,沿胸骨左緣第三、四肋間開胸,不弄破胸膜,維持自主呼吸,剪開心包,制作心包吊床,分離左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD),缺血前15min時(shí)靜脈注射實(shí)驗(yàn)藥物,于LAD中上1/3處(第一分支后),穿線結(jié)扎(ST段升高大于2mv標(biāo)志結(jié)扎成功), 15min后剪開結(jié)扎線(ST段驟降標(biāo)志再灌注成功),再灌注60min。

(三)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的記錄與測取

通過RM86型八道生理記錄儀記錄各組發(fā)生RA的時(shí)間、類型和各組缺血前、缺血15min、再灌注30min和60min時(shí)LVP曲線及曲線,測出左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)和dp/dtmax數(shù)值;并分別在以上各時(shí)間點(diǎn)抽血2~3ml檢測血清TNFα、NO值(分別由安徽中醫(yī)學(xué)院經(jīng)絡(luò)研究所同位素室及生化室測定)。實(shí)驗(yàn)完畢后,立即取下心臟,用生理鹽水沖洗干凈,在心臟結(jié)扎線以下,平行于冠狀溝沿心臟長軸均勻地將心室肌橫斷切成5片,然后置于1%紅四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L,pH7.4)中浸,37℃染色15min,壞死心肌不著色,存活心肌顯磚紅色。用濾紙吸干心肌表面的水分,稱取左室心肌與梗死心肌濕重,以梗死心肌濕重占左室心肌濕重的百分比來表示梗死范圍。

(四)室性心律失常的分類標(biāo)準(zhǔn)

室性心律失常按Lambeth標(biāo)準(zhǔn)分為室性纖維顫動(dòng)(VF)、室性心動(dòng)過速(VT)和僅有室性期前收縮(VPB)三類,其中VPB又根據(jù)Lown和Wolf標(biāo)準(zhǔn)分Ⅰ級(偶發(fā),<1bpm或30bph)、Ⅱ級(頻發(fā),> 6bpm或30bph)和Ⅲ級(多源)。按危險(xiǎn)性由低到高分為VPBⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級、VT、VF5級,如果同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)及以上級別的室性心律失常,則將其歸入級別最高的那一類。

(五)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用x檢驗(yàn),等級資料采用Ridit分析及U檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

35只家兔中,有3只在再灌注過程中因VF而死亡,其中Model組2只,TMP組1只。

(1)各組家兔在缺血前、缺血15min、再灌注30min及60min時(shí)由冠狀靜脈竇取血檢測TNFα、NO水平 結(jié)果(詳見表1)顯示,各組缺血前TNFα、NO值無明顯差異(P<0.05),除NO在缺血15min時(shí)均有所下降外,其他時(shí)間點(diǎn)兩者均持續(xù)升高,以再灌注60min時(shí)最為顯著(P<0.001),而各組之中又以Model組增高為甚,同Model組相比,GS+TMP組差異性最大(P<0.001)。

表1 各組家兔缺血前、缺血15min、再灌注30min和60min時(shí)血清TNFα、NO變化情況(x±s)

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;vsModelgroup:△P<0.001;vspreischaemia。

(2)再灌注后,所有家兔均在5min內(nèi)出現(xiàn)各種室性RA(詳見表2) 通過Ridit分析及U檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),同Model組相比,只有GS+ TMP組和Ver.組能夠顯著降低RA的危險(xiǎn)程度,而GS組和TMP組無顯著性差別。

表2 各組家兔在再灌注期間發(fā)生RA的情況

注:Ridit:*P<0.05vsModelGroup。

(3)左室舒縮功能參數(shù)值比較 心肌缺血前各組的左室舒縮功能參數(shù)值無明顯差異(P>0.05),缺血15min時(shí)均有明顯減退,再灌注30min時(shí)這一變化尤為顯著,隨后各組(除Model組外)舒縮功能雖有所恢復(fù),但同缺血前相比,仍有顯著差別(P<0.001)。同Model組相比,再灌注后各組收縮功能的減退程度均較之為小,但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的只有GS組(P<0.05)和GS+TMP組(P<0.01);各組舒張功能的減退程度亦較之為小,且都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,按顯著性由大到小的順序依次是Ver.組>GS+TMP組>MP組>GS組,詳見表3。

表3 各組家兔在缺血前、缺血15min、再灌注30min和60min時(shí)LVSP、±dp/dtmax和LVEDP變化情況(x±s)

續(xù)表

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,vsModelgroup;△P<0.001vspreischaemia。

(4)通過1%TTC染色后發(fā)現(xiàn)各組家兔心臟的左室前壁均出現(xiàn)心肌梗死。心肌梗死范圍(見表4)以Model組最大,與之相比,GS+ TMP組心肌梗死范圍最小(P<0.001),其次是GS組、Ver.組和TMP組(P<0.05)。

三、討論

心肌

IR損傷除與“鈣超載”“氧自由基”和“無復(fù)流現(xiàn)象”等因素密切相關(guān)外,近年來還發(fā)現(xiàn),TNFα和NO與心肌IR損傷之間有著密切聯(lián)系。

(1)TNFα ①能減弱心肌的收縮力;②能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(PMN)表達(dá)表面黏附因子,促進(jìn)PMN聚集,從而不僅增加了RA的發(fā)生率,而且還有助于PMN釋放活性氧和蛋白水解酶等物質(zhì),加重RI程度;③尚能刺激誘生型NO合成酶(inducible NOS,iNOS)合成釋放大量的NO,后者又可與超氧負(fù)離子迅速反應(yīng)生所過氧亞硝酸根(ONOO-),并進(jìn)一步產(chǎn)生氧化能力更強(qiáng)的羥自由基(OH-),致使組織損傷加重。

(2)iNOS 目前研究證實(shí), IR期間cNOS活性降低,iNOS活性卻顯著增高,大量釋放的NO是由iNOS合成的。后者不僅能通過上述自由基途徑發(fā)揮破壞效應(yīng),而且能夠減弱心肌舒縮功能,其機(jī)制可能是:①過量產(chǎn)生的NO使組織cGMP產(chǎn)生增加,激活cGMP依賴性蛋白激酶,減少細(xì)胞鈣內(nèi)流,抑制心肌收縮功能;②也可通過非cGMP依賴性途徑,激活胞漿內(nèi)ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶,催化ADP核糖基轉(zhuǎn)移到3磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH),抑制糖酵解供能。

急性心肌梗死(AMI)屬于中醫(yī)胸痹心痛范疇,其病機(jī)主要是氣虛血瘀,而臨床上心肌IR常發(fā)生于AMI期。根據(jù)中醫(yī)辨證施治原則,中藥防治心肌IR損傷宜使用益氣活血法。因此,我們從眾多臨床制劑中將GS與TMP注射液篩選出來并加以組合運(yùn)用,來考察兩者對家兔心肌IR損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GS和TMP合用能顯著降低RA的危險(xiǎn)程度,IR期間左室舒縮功能的減退(心肌頓抑主要表現(xiàn)為左室舒縮功能的低下)及再灌注后心肌梗死的范圍,還能顯著抑制IR期間TNFα和NO的大量釋放,且作用比單用及使用Ver.更顯著。因此,我們得出以下結(jié)論:①GS+TMP合用較單用對心肌IR損傷有著更為顯著的保護(hù)作用。這一事實(shí)說明,依據(jù)中醫(yī)辨證施治原則選取藥物,不僅有助于挖掘、篩選中藥及其提取物,而且還顯著提高了臨床療效。②GS+TMP對IR期間TNFα和NO大量釋放的抑制程度與其對心肌IR損傷的保護(hù)作用之間存在著相平行的關(guān)系,表明它們除了能通過阻止心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載的出現(xiàn),降低氧自由基的產(chǎn)生及改善心肌微循環(huán)等途徑以外,還能通過顯著抑制TNFα和NO的大量釋放,來發(fā)揮其對心肌IR損傷的保護(hù)作用。至于GS+TMP是直接抑制iNOS合成NO,還是通過抑制TNFα來減少iNOS合成NO,尚有待于進(jìn)一步研究。

表4 各組家兔再灌注后心肌梗死范圍(x±s)

注:^*P<0.05***P<0.001,vsModelgroup。