基因工程在糖苷酶研究中的應(yīng)用_關(guān)于馬福祥的故事

進入21世紀(jì)前后，張樹政開創(chuàng)的糖苷酶研究，在她的學(xué)生和接班團隊的繼續(xù)研究中，更多地采用了基因工程手段。

有張樹政署名的有關(guān)酶基因工程的論文，最早的是1995年發(fā)表在《生物工程學(xué)報》上的“耐熱DNA聚合酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達”，雖然研究的是耐熱DNA聚合酶，但表明該研究集體已經(jīng)掌握有關(guān)技術(shù)并開始在基因工程研究中得到成功。隨后張樹政的研究生們在《中國科學(xué)》上發(fā)表了“西方許旺酵母α淀粉酶的基因克隆及其在啤酒酵母中的高效表達與分泌”，他們自許旺氏酵母中克隆了α淀粉酶基因，并在釀酒酵母中表達，其優(yōu)點是具有明顯的脫枝鏈活力，即水解α1，6糖苷鍵水解活力，這是葡萄糖淀粉酶催化活力的一部分，可部分代替葡萄糖淀粉酶功能，該酶可在60℃被不可逆抑活，可方便地滅活，不影響后續(xù)工藝，在釀酒和面包焙制過程中有特殊優(yōu)點。高效表達和分泌α淀粉酶，從而使酵母菌能直接以淀粉為碳源進行發(fā)酵。同時由于選用了原養(yǎng)型啤酒酵母作為受體菌株，利用生成菌株轉(zhuǎn)化，可直接測定該誘變菌株的工藝用途，如產(chǎn)酒精等，其結(jié)果可指導(dǎo)生產(chǎn)。

(一) 人胎肝唾液酸轉(zhuǎn)移酶

張樹政在1998年曾指導(dǎo)過有關(guān)產(chǎn)生唾液酸的菌種篩選工作，后來，她和她的學(xué)生們在了解到唾液酸轉(zhuǎn)移酶的研究，是了解糖綴合物唾液酸化的調(diào)控機制的關(guān)鍵，但此時對其如何調(diào)控而導(dǎo)致多種細胞過程的原因，尚知之甚少。當(dāng)時已知至少有12種不同的有嚴(yán)格底物特異性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，為研究人胎肝唾液酸化糖綴合物的生物合成機制及了解它們在胚胎時期及疾病過程中的生物學(xué)作用，他們試圖用已克隆的13種唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的序列信息分離人胎肝唾液酸轉(zhuǎn)移酶cDNA。從人胎肝cDNA文庫中克隆了一個編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的cDNA。這項更多屬于基礎(chǔ)性研究的成果，為糖生物學(xué)的深入研究作了初步的工作。他們又以這些研究結(jié)果為基礎(chǔ)，利用基因工程手段，獲得了生產(chǎn)唾液酸的某些菌種，為將來投入生產(chǎn)作了一定的準(zhǔn)備。

(二) 海藻糖(123shoppingwar.com)海藻糖作為一種非還原性二糖，廣泛存在于藻類、細菌、酵母菌、昆蟲和無脊椎動物體內(nèi)，除作為一種儲存性碳源外，還可以在生物處于逆境時有效保護細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等。海藻糖的用途十分廣泛，如可以用來替代血漿作為疫苗等生物制品的穩(wěn)定劑。由于在酵母菌細胞中海藻糖由6磷酸海藻糖合成酶和海藻糖磷酸酯酶兩種酶的作用進行合成，張樹政研究組在篩選到高產(chǎn)海藻糖的釀酒酵母菌株，構(gòu)建了其cDNA文庫，并從中克隆到6磷酸海藻糖合成酶基因，然后他們將來源于嗜酸熱古菌芝田硫化葉菌B12的麥芽寡糖基海藻糖合酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因在大腸桿菌中獲得表達，利用這兩種酶，分別以麥芽寡糖和淀粉為轉(zhuǎn)化底物，在pH5.5，60℃條件下合成海藻糖。同時得知這兩種酶合成海藻糖時能利用的最小底物是麥芽四糖，海藻糖產(chǎn)率與麥芽寡糖鏈長正相關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)兩個酶都具有輕微的α1，4葡萄糖苷酶活性，能在麥芽寡糖還原末端水解α1，4糖苷鍵，生成葡萄糖分子，推測海藻糖合成酶可能有兩個不同的催化活性中心?；蚬こ叹昕稍诔嘏囵B(yǎng)，生長快，產(chǎn)酶活力高，重組酶與原始菌株的酶具有同樣好的性能，很有工業(yè)化應(yīng)用前景。為提高該基因工程菌中新型淀粉酶的表達水平，提高其酶活力，對影響該工程菌表達的條件作了研究。他們還發(fā)現(xiàn)了其中一種是新型的α淀粉酶，其底物特異性和水解方式非常特殊。張樹政領(lǐng)導(dǎo)的研究組還研究過L門冬酰胺酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達,并對該酶的工程菌株之培養(yǎng)條件及穩(wěn)定性進行過研究。還進行過多聚唾液酸對L天冬酰胺酶的修飾及修飾酶特性研究。

截至2008年，張樹政開創(chuàng)的研究組的科研工作者們在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表了20多篇有關(guān)糖的基因工程文章，其中仍以糖苷酶有關(guān)的內(nèi)容為主。既有某些編碼酶的基因的克隆與測序，也有基因表達和表達產(chǎn)物的純化與性質(zhì)研究。