三、基因的檢測和分析

核酸分子雜交和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是基因診斷的兩大基本技術(shù)。

（一）核酸分子雜交

Southern印跡雜交和Northern雜交：用1種或多種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片段，隨后使DNA在原位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持體（通常是硝酸纖維素膜或尼龍膜）上。DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體的過程中，各個DNA片段的相對位置保持不變。用放射性核素或生物素等標記的DNA或RNA探針與固著于濾膜上的DNA雜交，經(jīng)放射自顯影或通過顏色改變確定樣本中和探針互補的條帶。此法可用于分析DNA的結(jié)構(gòu)，如DNA限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析。在DNA定量比較準確的基礎(chǔ)上，通過雜交條帶的光密度掃描可以進行粗略的基因定量。圖15－1示Southern印跡雜交法用于基因診斷的基本過程。

圖15－1　Southern印跡雜交法模式圖

應(yīng)用印跡雜交技術(shù)也可檢測基因的表達產(chǎn)物RNA及其表達水平，稱Northern雜交。（二）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸（dNTP）存在的條件下，由耐熱DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）在體外酶促合成雙鏈DNA反應(yīng)。PCR的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為3步：①變性：通過加熱破壞DNA雙鏈之間的氫鍵，使之解離成單鏈DNA。②退火：當溫度突然降低時，由于模板DNA的分子結(jié)構(gòu)比引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物量大大多于模板DNA，因此引物與其互補的模板DNA在局部形成雜交雙鏈，而模板DNA雙鏈之間復(fù)性的機會較少。③延伸：在dNTP底物和Mg^2＋存在的條件下，DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)。以上3步為一個循環(huán)，每一輪擴增的產(chǎn)物可作為下一輪擴增的模板，所以每一個循環(huán)都使模板DNA分子增加2倍。數(shù)小時之后，樣本DNA分子大量復(fù)制，可達200萬拷貝。PCR的原理示意參見圖15－2。

圖15－2　聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）原理示意圖

PCR模擬細胞核內(nèi)的天然DNA復(fù)制過程，在幾小時內(nèi)使目的基因擴增百萬倍，顯著提高基因診斷的靈敏度，PCR的優(yōu)勢：①簡便：樣品DNA不需要很純，不必提取DNA，直接用溶解的白細胞、羊水細胞和絨毛即可進行DNA擴增，這對胎兒的產(chǎn)前診斷更為適宜。②靈敏：0．1μg DNA足夠用于PCR，單個卵裂球、單個淋巴細胞、單個精子、口腔黏膜脫落細胞、干血跡和發(fā)根、甚至考古所得的古代生物材料等都可作PCR擴增。③快速：分子雜交至少需要數(shù)周時間，而PCR可在幾天甚至幾小時內(nèi)獲得診斷結(jié)果。④不需基因探針：由于目的DNA已擴增了上百萬倍，通過電泳分離、溴乙啶染色就可在紫外線下直接觀察待測基因或片斷。

PCR衍生技術(shù)有：

（1）錨定PCR（anchored PCR）先用DNA末端轉(zhuǎn)移酶在DNA3′端加上poly（dG）尾，再用錨引物poly（dG）與基因特異引物配對進行PCR。錨定PCR可以擴增序列未知或未全知的核酸片段。

（2）不對稱PCR（asymmetric PCR）標準PCR的2種引物濃度相等，產(chǎn)物是雙鏈DNA；不對稱PCR的兩種引物濃度比為50～100∶1，得到的是單鏈DNA，可用于DNA測序。

（3）反向PCR（inverse PCR）用于擴增已知DNA片段兩側(cè)的未知序列。用已知序列內(nèi)部沒有識別位點的限制性內(nèi)切酶切割此段DNA，再把它連接成環(huán)狀，用合適方向的與已知兩末端互補的引物即可擴增出未知序列的DNA片段?；蚪M步移文庫即由本法建立。

（4）多重等位基因特異性PCR（multiplex allele－specific amplification，MASPCR）設(shè)計一組等位基因特異性引物，并把突變基因和正?；蛩煌哪且粋€或幾個堿基設(shè)計在引物的3′端，通過適合的組合和調(diào)整，使它們組成一個多重等位基因特異性PCR體系。這樣通過一次PCR就可以檢測到一組不同的突變類型。

（5）巢式PCR（nested PCR）巢式PCR使用兩對引物，進行2次PCR反應(yīng)，第2次PCR的引物位于第1次PCR的擴增范圍之內(nèi)；或者1個引物與第1次的相同，另一個引物位于第1次擴增的范圍之內(nèi)。兩次PCR循環(huán)條件相同，但第2次反應(yīng)以第一次的產(chǎn)物為模板。巢式PCR用于擴增極微量的DNA樣品。

（6）熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q－PCR）FQ－PCR在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，添加了一條標記2個熒光基因的探針，一個標記在5′端，稱為熒光報告基因（R）；另一個標記在探針的3′端，稱為熒光抑制基因（Q）。兩者可構(gòu)成能量的傳遞結(jié)構(gòu)，即5′端熒光基團所發(fā)出的熒光可被另一熒光基團吸收或抑制，探針的3′端羥基（—OH）已被去除或封閉，不具有延伸能力。探針在無特異性PCR發(fā)生時，熒光信號不改變。當有特異性PCR擴增發(fā)生時，探針在PCR過程中被Taq酶的5′→3′活性作用而切斷，抑制作用消失，從而引起報告熒光信號的增長，熒光信號伴隨著PCR進行，依PCR產(chǎn)物的增長而增長，故在PCR進行過程中，連續(xù)不斷地測定反應(yīng)體系中的熒光信號的變化。當信號增強到某一閾值時，循環(huán)參數(shù)（Ct值）被記錄下來，該循環(huán)參數(shù)與PCR體系中起始的DNA量的對數(shù)值之間具有嚴格的線性關(guān)系，利用陽性梯度標準品的Ct值，制成標準曲線，再根據(jù)樣品的Ct值可以準確地定量起始DNA的數(shù)量。