實驗三　血清（漿）葡萄糖測定（葡萄糖氧化酶法）

【教學(xué)目標】

（1）了解葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖的原理。

（2）掌握血清葡萄糖測定的操作技術(shù)及臨床意義。

【實驗原理】

葡萄糖氧化酶（GOD）能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并釋放出過氧化氫。生成的過氧化氫在過氧化物酶（POD）的催化下，分解為水和氧，并使色原性氧受體4－氨基安替比林和酚縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應(yīng)。紅色醌類化合物的生成量與葡萄糖含量呈正比。

【試劑】

（1）0．1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7．0）：稱取無水磷酸氫二鈉8．67g及無水磷酸二氫鉀5．3g溶于800mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉（或1mol/L鹽酸）將溶液pH值調(diào)至7．0，用蒸餾水定容至1L。

（2）酶試劑：稱取過氧化物酶1200U、葡萄糖氧化酶1200U、4－氨基安替比林10 mg、疊氮鈉100mg，溶于磷酸鹽緩沖液80mL中，用1mol/L NaOH將溶液pH值調(diào)至7．0，用磷酸鹽緩沖液定容至100mL。最后，置于4℃中保存，可穩(wěn)定3個月。

（3）酚溶液：稱取重蒸餾酚100mg溶于蒸餾水100mL中，用棕色瓶儲存。

（4）酶酚混合試劑：酶試劑及酚溶液等量混合，在4℃中可以存放1個月。

（5）12mmol/L苯甲酸溶液：溶解苯甲酸1．4g于約800mL蒸餾水中，加溫助溶，冷卻后加蒸餾水定容至1L。

（6）100mmol/L葡萄糖標準儲存液：稱取已干燥恒重的無水葡萄糖1．802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液約70mL中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100mL。2h以后方可使用。

（7）5mmol/L葡萄糖標準應(yīng)用液：吸取葡萄糖標準儲存液5．0mL置于100mL容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至需要刻度，混勻。

【器材】

半自動生化分析儀或721型分光光度計；試管、吸管、試管架、水浴箱、加樣器。

【操作】

（1）自動分析法：按儀器說明書的要求進行測定。

（2）手工操作法：取試管三支，按實驗表3－1操作。

實驗表3－1　葡萄糖氧化酶法測血清葡萄糖操作步驟

續(xù)表

混勻，置于37℃水浴箱中，保溫15min，在波長505nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取標準管及測定管吸光度。

【計算】

【參考范圍】

空腹時血清葡萄糖含量為3．89～6．11mmol/L。

【臨床意義】

（1）生理性高血糖癥可見于攝入高糖食物后，或情緒緊張腎上腺分泌增加時。

（2）病理性高血糖癥：

①糖尿?。翰±硇愿哐前Y常見于胰島素絕對或相對不足的糖尿病患者。

②內(nèi)分泌腺功能障礙：常見于甲狀腺功能亢進、腎上腺皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進。因此而引起的各種對抗胰島素的激素分泌過多也會出現(xiàn)高血糖癥。注意，升高血糖的激素增多引起的高血糖癥，現(xiàn)已歸入特異性糖尿病中。

③顱內(nèi)壓增高：顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞，如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等。

④脫水引起的高血糖癥：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖濃度輕度升高。

（3）生理性低血糖癥：常見于饑餓和劇烈運動時。

（4）病理性低血糖癥（特發(fā)性功能性低血糖癥最多見，依次是藥源性低血糖癥、肝源性低血糖癥、胰島素瘤等）。

①胰島β細胞增生或胰島β細胞瘤等，使胰島素分泌過多。

②對抗胰島素的激素分泌不足，如垂體前葉功能減退、腎上腺皮質(zhì)功能減退和甲狀腺功能減退而使生長素、腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少。

③嚴重肝病患者，由于肝臟儲存糖原及糖異生等功能低下，肝臟不能有效地調(diào)節(jié)血糖濃度。

【注意事項】

（1）葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。因為尿液中的尿酸等干擾物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。

（2）測定標本以草酸鉀－氟化鈉為抗凝劑的血漿較好。取草酸鉀6g，氟化鈉4g。加水溶解至100mL。吸取0．1mL到試管內(nèi)，在80℃以下烤干使用，可使2～3mL血液在3～4d內(nèi)不凝固，并能抑制糖分解。

（3）本法樣品、標準用量甚微。加樣器的使用要規(guī)范，應(yīng)注意標本及標準移液量要準確，以保證結(jié)果可靠。

（4）嚴重黃疸、溶血及乳糜樣血清應(yīng)先制備無蛋白血濾液，然后再進行測定。

（5）本法第一步是特異反應(yīng)，第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應(yīng)的第二步。一些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素C、膽紅素和谷胱甘肽等，可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，使測定結(jié)果偏低。

【思考題】

（1）血糖樣品為什么要求立即檢測或及時分離血清？

（2）測定血糖時，以草酸鉀－氟化鈉為抗凝劑的血漿樣品為什么較其他抗凝劑的血漿樣品好？

（王易振）