淀粉酶發(fā)酵制備技術(shù)_生物工藝學(xué)實(shí)驗指

綜合實(shí)驗十一　淀粉酶發(fā)酵制備技術(shù)

一、背景知識

淀粉酶是具有水解淀粉和糖原能力酶類的統(tǒng)稱，廣泛存在于動植物和微生物中。淀粉酶可以將自然界中廣泛存在的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖或低聚糖等可發(fā)酵性糖，是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種之一。淀粉酶按照水解糖苷鍵方式的不同可以分為五大類。

（一）α-淀粉酶

α-淀粉酶全稱為α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，又叫淀粉-1，4-糊精酶，液化酶是一種內(nèi)切酶，從淀粉分子內(nèi)部隨機(jī)切割α-1，4-糖苷鍵，生成糊精和還原糖，從而使淀粉糊的黏度迅速下降，達(dá)到淀粉液化的作用，俗稱液化酶。因產(chǎn)物的末端殘基碳原子構(gòu)型為α-構(gòu)型，學(xué)名為α-淀粉酶。α-淀粉酶不能水解支鏈淀粉分支點(diǎn)的α-1，6-糖苷鍵，也不能水解α-1，6-糖苷鍵附近的α-1，4-糖苷鍵。微生物來源的α淀粉酶主要來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（A.niger）等。細(xì)菌來源的α淀粉酶一般熱穩(wěn)定性比較好，最適作用pH一般為6.0～8.0中性范圍。在工業(yè)上α-淀粉酶用途及其廣泛，已經(jīng)用于食品、發(fā)酵、谷物加工、紡織、造紙、醫(yī)藥、輕化工業(yè)、石油開采等各個領(lǐng)域，其中最大的用途是酶法生產(chǎn)葡萄糖、飴糖、棉布退漿、酒精發(fā)酵等。

（二）β-淀粉酶

β-淀粉酶又叫淀粉-1，4-麥芽糖苷酶，是一種外切型淀粉酶，從底物非還原性末端依次水解每間隔一個的α-1，4-糖苷鍵，終產(chǎn)物是麥芽糖。其酶制劑的來源曾經(jīng)長期依賴于麥芽、甘薯和大豆。隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，目前已經(jīng)開發(fā)了很多微生物生產(chǎn)菌種，主要有芽孢桿菌屬的蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、凝結(jié)芽孢桿菌（B.coaglans）、多黏芽孢桿菌（B.polymyxa）等。β淀粉酶主要用于淀粉糖的生產(chǎn)，如飴糖、高麥芽糖漿等。

（三）葡萄糖淀粉酶

葡萄糖淀粉酶又稱糖化酶，是一種外切酶，水解方式是從淀粉或寡糖的非還原性末端開始，逐個切除葡萄糖分子。與β-淀粉酶相似，水解產(chǎn)生的游離半縮醛羥基發(fā)生轉(zhuǎn)位作用，釋放β-葡萄糖。它不僅能水解α-1，4-糖苷鍵，還能水解α-1，6-糖苷鍵和α-1，3-糖苷鍵，只是水解后兩者的速度較前者要慢得多，因此葡萄糖淀粉酶作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉時，其水解終產(chǎn)物全部為葡萄糖。許多微生物都可以產(chǎn)生葡萄糖淀粉酶，其中被研究較多的是真菌葡萄糖淀粉酶，工業(yè)上應(yīng)用最多的是來自于黑曲霉（A.niger）和米根霉（Rhizopus oryzae）的葡萄糖淀粉酶。葡萄糖淀粉酶在工業(yè)上的主要用途是作為淀粉的糖化劑，是淀粉工業(yè)轉(zhuǎn)化的主要水解酶。與α-淀粉酶一起廣泛用于淀粉糖的生產(chǎn)和發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。在酒精、白酒發(fā)酵生產(chǎn)中代替酒曲，可提高糖化率，提高出酒率。在啤酒加工中，可生產(chǎn)低糖干啤酒等。

（四）解枝酶（異淀粉酶）

解枝酶（異淀粉酶）又叫淀粉-1，6-葡萄糖苷酶，是能夠?qū)Ｒ坏厍虚_支鏈淀粉和糖原等分支點(diǎn)的α-1，6-糖苷鍵，從而形成長短不一的直鏈淀粉的一類淀粉酶。異淀粉酶的來源非常廣泛，動植物和微生物中都發(fā)現(xiàn)了異淀粉酶。能夠產(chǎn)生異淀粉酶的微生物主要包括產(chǎn)氣桿菌（Aerobacter aerogene）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）等。

（五）環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶

環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶功能為切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子供體內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵并將其轉(zhuǎn)移到受體糖鏈上重新形成α-1，4-糖苷鍵。環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶具有很低的水解活性，其轉(zhuǎn)移活性體現(xiàn)在可使6～8個寡糖分子環(huán)化，并形成具有高度分支的糊精或環(huán)狀極限糊精。

二、實(shí)驗簡介

本實(shí)驗包括產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離篩選、紫外誘變、深層發(fā)酵、黃曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶以及淀粉酶活力測定的幾種不同方法等內(nèi)容，學(xué)生學(xué)習(xí)后可全面掌握淀粉酶生產(chǎn)菌的獲取、發(fā)酵等工藝技術(shù)，為今后從事酶制劑的生產(chǎn)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

實(shí)驗11-1　產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的分離

（一）實(shí)驗?zāi)康?/p>

使學(xué)生掌握從自然界中分離淀粉酶產(chǎn)生菌及淀粉酶活力測定的方法，培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計實(shí)驗流程、判斷實(shí)驗結(jié)果的能力，并對所學(xué)習(xí)過的微生物實(shí)驗方法進(jìn)行綜合技能訓(xùn)練。

（二）實(shí)驗原理

許多微生物都能產(chǎn)生淀粉酶，細(xì)菌中的芽孢桿菌是常見的淀粉酶產(chǎn)生菌。本實(shí)驗將土壤樣品懸液加熱處理，殺死非芽孢細(xì)菌及其他微生物菌體，通過平板分離可獲得細(xì)菌的單菌落，經(jīng)芽孢染色可判斷分離菌株是否為芽孢桿菌。將單菌落接種至淀粉平板，凡是具有產(chǎn)淀粉酶能力的芽孢桿菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周圍會出現(xiàn)水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液后，未水解的淀粉呈藍(lán)色，水解圈無色，由此可分離得到產(chǎn)淀粉酶的菌株。

液化型淀粉酶能將淀粉水解成糊精以及少量麥芽糖和葡萄糖，使淀粉對碘呈藍(lán)色的臭特異性逐漸消失，該顏色消失的速度可衡量酶的活力。

（三）實(shí)驗材料與裝置

1.材料

自行分離產(chǎn)生淀粉酶的芽孢桿菌。

2.培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

（2）平板分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

（3）淀粉培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH 7.2。

（4）產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉8g，豆餅粉4g，蛋白胨0.5g，KH2PO40.5g，（NH4）2SO40.5g，Na2HPO40.8g，水100mL，pH自然。

3.試劑

（1）碘原液：稱取11.0g碘和22.0g碘化鉀，用少量水溶解，定容至500mL，儲存于棕色瓶中。

（2）標(biāo)準(zhǔn)稀碘液：吸取2.00mL原碘液，加20.0g碘化鉀，用水完全溶解后，定容至500mL，儲存于棕色瓶中。

（3）2%可溶性淀粉溶液：稱取2.00g可溶性淀粉，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70mL沸水中，用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱到完全透明，冷卻定容至100mL。此溶液當(dāng)天配制當(dāng)天使用。

（4）0.02mol/L、pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱取Na2HPO4·12H2O 45.23g，檸檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用蒸餾水溶解定容至1000mL，配好后用pH計校正pH為6.0。

（5）標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液：將0.03g糊精加入90mL煮沸的蒸餾水中，冷后定容至100mL，滴加甲苯3～5滴，冰箱保存。

（6）盧戈氏碘液：碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300mL。

（7）芽孢染色液：

①50g/L孔雀綠溶液；②50g/L番紅水溶液；③苯酚品紅溶液：堿性品紅11g，無水乙醇100mL。取上述溶液10mL與100mL50g/L苯酚溶液混合，過濾。

4.儀器和其他裝置

三角瓶、燒杯、量筒、容量瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿、試管、水浴鍋、滅菌器、顯微鏡、搖床、白瓷板等。

（四）實(shí)驗方法與步驟

1.分離

（1）采集土樣，用無菌水制備1∶10土壤懸液。

（2）取上述土壤懸液5mL，注入已滅菌的試管中，將此試管放入80℃左右水浴中熱處理10min，以殺死無芽孢桿菌及其他微生物，濃縮芽孢桿菌。

（3）用平板劃線法分離單菌落，37℃培養(yǎng)24～48h。

（4）選取表面干燥、粗糙、不透明、污白色或微帶黃色的單菌落進(jìn)行編號。通過芽孢染色判斷所選菌落是否為芽孢桿菌。

2.篩選

（1）從已判斷為芽孢桿菌的菌落處，分別挑取少許菌苔，先接種至含淀粉的斜面培養(yǎng)，再接種至淀粉平板。37℃培養(yǎng)24～48h，在淀粉平板上滴加盧戈氏碘液后測定菌苔的直徑和水解圈的大小。

（2）選擇水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌落，接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)48h，將發(fā)酵液過濾或離心，取上清液檢測淀粉酶活力。

3.淀粉酶活力檢測（Wohlgemuth Hagihara改良法）

（1）吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液，置于盛有3mL標(biāo)準(zhǔn)稀碘液的試管中，混勻，作為比較顏色的標(biāo)準(zhǔn)管。

（2）于白瓷板空穴滴入1.5mL稀碘液。在25mm×200mm試管中，加入2%可溶性淀粉20mL，pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液5mL，在60℃水浴中預(yù)熱4～5min，加入稀釋好的酶液0.5mL，充分混勻，立即計時，定時取0.5mL反應(yīng)液加入預(yù)先滴有稀碘液的白瓷板空穴中，當(dāng)顏色反應(yīng)由紫色變成紅棕色，與標(biāo)準(zhǔn)比色管顏色相同時，即到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，記錄反應(yīng)總時間即為液化時間。酶反應(yīng)全部時間控制在2～2.5min，測定時照明采用日光燈。

（3）酶活力計算

以1mL酶液于60℃、pH 6.0的條件下，在1h內(nèi)液化可溶性淀粉的克數(shù)來表示［g可溶性淀粉/（mL·h）］。

式中，n為酶液稀釋倍數(shù)，20為可溶性淀粉溶液的毫升數(shù)，2%為可溶性淀粉濃度，0.5為測定時所用酶量，60為分鐘數(shù)，t為測定時記錄的液化時間。

實(shí)驗11-2　淀粉酶生產(chǎn)用枯草芽孢桿菌的紫外誘變

（一）實(shí)驗?zāi)康?/p>

1.觀察紫外線對枯草芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶的誘變效應(yīng)。

2.學(xué)習(xí)并掌握物理誘變育種的方法。

（二）實(shí)驗原理

物理誘變因子中以紫外線輻射的使用最為普遍，其他物理誘變因子則受設(shè)備條件的限制，難以普及。一般用于誘變育種的物理因子有60Co、γ-射線和高能電子流β-射線等。紫外線作為物理誘變因子用于工業(yè)微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，盡管幾十年來各種新的誘變劑不斷出現(xiàn)并應(yīng)用于誘變育種，但到目前為止，對于經(jīng)誘變處理后得到的高單位抗生素產(chǎn)生菌種中，有80%左右是通過紫外線誘變后經(jīng)篩選而獲得的，因此，對于微生物菌種選育工作者來說，紫外線作為誘變因子還是應(yīng)該首先考慮的。

紫外線的波長在200～300nm，但對誘變最有效的波長僅僅是253～265nm，一般紫外線殺菌燈所發(fā)射的紫外線波長大約有80%是254nm。紫外線誘變的主要生物學(xué)效應(yīng)是由DNA變化造成的，DNA對紫外線有強(qiáng)烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感。紫外線引起DNA結(jié)構(gòu)變化的形式很多，如DNA鏈的斷裂、堿基破壞等，但其最主要的作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。

經(jīng)紫外線損傷的DNA能被可見光照射而復(fù)活，因此，經(jīng)誘變處理后的微生物菌種要避免長波紫外線和可見光的照射，故經(jīng)紫外線照射后樣品需要黑紙或黑布包裹。另外，照射處理后的孢子懸液不要儲放太久，以免突變在黑暗中修復(fù)。

（三）實(shí)驗材料

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CICC 10033，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨、固體培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基。

藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCI、可溶性淀粉、碘液。

儀器及其他用具：試管、移液管、三角瓶、量筒、燒杯、20W紫外燈、磁力攪拌器、離心機(jī)、滅菌器、超凈工作臺等。

（四）實(shí)驗方法與步驟

1.按要求配制培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基、生理鹽水及所需器皿滅菌，備用

2.誘變

取已培養(yǎng)20h的活化枯草芽孢桿菌斜面一支，用10mL生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，強(qiáng)烈振蕩10min，以打碎菌塊，離心（轉(zhuǎn)速3000r/min）15min，棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2次，最后制成菌懸液，用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為108cfu/mL。

將淀粉瓊脂培養(yǎng)基熔化后，冷卻至45℃左右倒平板，凝固后待用。正式照射前開啟紫外燈預(yù)熱10min。取制備好的菌懸液4mL移入直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿中，放入無菌磁力攪拌捧，放在磁力攪拌器上、20W紫外燈下30cm處，然后打開皿蓋邊攪拌邊照射，照射時間分別為1min、2min、3min、5min?？梢岳鄯e照射，也可以分別照射不同時間。

在紅外燈下分別取未照射的菌懸液（作為對照）和照射過的菌懸液各0.5mL進(jìn)行不同程度的稀釋，取最后三個稀釋度的稀釋液涂布于淀粉培養(yǎng)基平板上。每個稀釋度涂3個平板，每個平板加稀釋液0.1mL，用無菌玻璃涂布棒涂勻，37℃下培養(yǎng)48h（用黑布包好平板）。注意在每個平板背后要標(biāo)明處理時間、稀釋度、組別等信息。

3.計算存活率及致死率

將培養(yǎng)48h后的平板取出進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)平板上的菌落數(shù)，計算出對照樣品1mL菌液中的活菌數(shù)。

4.觀察誘變效應(yīng)

在平板菌落計數(shù)后，分別向菌落數(shù)在5～6個的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈，分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計算比值（HC值），與對照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果說明紫外線對枯草芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶誘變的效果，選取HC值大的菌落移接到新鮮牛肉膏斜面上培養(yǎng)。此斜面可作復(fù)篩用。

（五）實(shí)驗結(jié)果與分析

將實(shí)驗結(jié)果按表1-11-1要求如實(shí)填入，并分別計算出存活率、致死率。

表1-11-1　紫外線處理對枯草芽孢桿菌的影響

（六）實(shí)驗注意事項

紫外線操作應(yīng)在暗室中或晚上進(jìn)行，誘變后應(yīng)避光保存菌種，避免回復(fù)突變。

實(shí)驗11-3　枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶

（一）實(shí)驗?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)掌握α-淀粉酶發(fā)酵試驗的基本原理、控制條件和操作方法。

2.學(xué)習(xí)α-淀粉酶酶活力測定的具體操作方法。

（二）實(shí)驗原理

α-淀粉酶（α-amylase，EC3.2.1.1）能分解淀粉（天然底物通常是α-1，4-糖苷鍵），能以隨機(jī)的方式切割淀粉分子內(nèi)部的α-1，4-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)物為糊精、低聚糖和單糖類，使淀粉的黏度迅速降低而還原力逐漸增加。α-淀粉酶作為安全高效的生物催化劑，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、制藥、紡織和石油開采等諸多領(lǐng)域。特別是廣泛應(yīng)用在食品與釀造的許多生產(chǎn)領(lǐng)域，如酶法生產(chǎn)葡萄糖及果葡糖漿、酒精及味精等生產(chǎn)中，是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑之一。α-淀粉酶的主要生產(chǎn)菌有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌等。

目前，工業(yè)上主要是利用深層發(fā)酵法，大規(guī)模生產(chǎn)α-淀粉酶。我國從1865年開始應(yīng)用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BF-7658生產(chǎn)α-淀粉酶，當(dāng)時僅無錫酶制劑廠獨(dú)家生產(chǎn)。現(xiàn)在國內(nèi)生產(chǎn)酶制劑的廠家已發(fā)展到上千個，其中約有近一半的工廠生產(chǎn)α-淀粉酶，總產(chǎn)量上萬噸。目前工業(yè)化生產(chǎn)所使用的菌株大多是由野生菌株經(jīng)多次誘變的突變株。

近幾年來，耐高溫α-淀粉酶的研究相當(dāng)活躍，國外生產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶發(fā)展較快，已從嗜熱真菌、高溫放線菌，特別是從嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilust）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformus）等中分離得到了耐高溫的α-淀粉酶菌種。國內(nèi)雖已開展了耐高溫α-淀粉酶的研究工作，但目前仍以枯草桿菌菌株生產(chǎn)α-淀粉酶為主。

（三）實(shí)驗材料

1.微生物菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CICC 10080，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

2.培養(yǎng)基與試劑

（1）馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基。

（2）馬鈴薯、蔗糖、瓊脂、可溶性淀粉、豆餅粉、玉米粉、Na2HPO4、（NH4）2SO4、NH4Cl、CaCl2。

（3）原碘液：稱取11.0g碘和22.0g碘化鉀，用少量水溶解，定容至500mL，儲存與棕色瓶中。

（4）稀碘液：吸取2.00mL原碘液，加20.0g碘化鉀，用水完全溶解后，定容至500mL，儲存與棕色瓶中。

（5）2%可溶性淀粉溶液：稱取2.00g可溶性淀粉，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩緩加入70mL沸水中，用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌加熱到完全透明，冷卻定容至100mL。此溶液當(dāng)天配制當(dāng)天使用。

（6）磷酸緩沖液（pH 6.0）：稱取Na2HPO4·12H2O 45.23g，檸檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用蒸餾水溶解定容至1000mL，配好后用pH計校正pH為6.0。

（7）0.1mol/L鹽酸。

3.儀器設(shè)備

超凈工作臺、電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計、酸度計、高壓滅菌鍋、電爐。

4.其他材料

三角瓶、無菌吸管、精密pH試紙、比色用白瓷板。

（四）實(shí)驗方法與步驟

1.培養(yǎng)基的制備

（1）制備馬鈴薯培養(yǎng)基斜面

培養(yǎng)基組成：馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂2g，水100mL，pH自然。

配制方法：馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，熔化后補(bǔ)足水至100mL，分裝于試管，于121℃滅菌20min，擺成斜面。

（2）制備種子培養(yǎng)基

配制種子培養(yǎng)基：豆餅粉3%，玉米粉2%，Na2HPO40.6%，（NH4）2SO40.3%，NH4Cl 0.1%，pH 6.5。

分裝入250mL三角瓶中（50mL/瓶），于121℃滅菌20min，冷卻后備用。

（3）制備發(fā)酵培養(yǎng)基

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉8%，豆餅粉4%，玉米漿2%，Na2HPO40.4%，（NH4）2SO40.3%，NH4Cl 0.1%，CaCl20.2%，pH 6.5。

分裝入500mL三角瓶中（50mL/瓶），于121℃滅菌20min，冷卻后備用。

2.液體種子的制備

（1）斜面菌種活化

取枯草芽孢桿菌菌苔1環(huán)，移接于馬鈴薯培養(yǎng)基斜面上。

置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～16h，備用。

（2）制備液體種子

取經(jīng)活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種2環(huán)，移接于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。

置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37℃振蕩培養(yǎng)16h，備用。

3.α-淀粉酶的發(fā)酵

（1）α-淀粉酶發(fā)酵

吸取液體種子培養(yǎng)物5mL，移接于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中。

置于電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱中于37℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)36h。

每隔4h取樣，測定發(fā)酵培養(yǎng)液的pH，OD和酶活性，并做記錄。

（2）α-淀粉酶活性測定

吸取20mL可溶性淀粉溶液，加入磷酸緩沖液5.0mL，搖勻后，置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱8min。

加入1mL稀釋好的酶液，立即計時，搖勻，反應(yīng)5min。

立即用移液槍吸取1.0mL反應(yīng)液，加到預(yù)先盛有0.5mL鹽酸溶液和5.0mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5mL鹽酸溶液和5.0mL稀碘液為空白，于660nm波長下，用10mm比色皿迅速測定其吸光度（A），根據(jù)吸光度從下表查得測試酶液的濃度。

酶活力計算：

式中：X1—酶活力（U/mL），c—測試酶樣濃度（μ/mL），n—樣品的稀釋倍數(shù)。

表1-11-2　吸光度與測試α-淀粉酶酶濃度對照表

續(xù)　表

（五）實(shí)驗結(jié)果與分析

1.記錄枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生α-淀粉酶的整個試驗過程。

2.記錄所測定的發(fā)酵液α-淀粉酶活性，并根據(jù)測定結(jié)果闡述枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特點(diǎn)。

3.將每隔4h取樣所測得的發(fā)酵培養(yǎng)液的pH，OD和酶活性結(jié)果，繪制成發(fā)酵過程曲線。

（六）實(shí)驗注意事項

1.α-淀粉酶酶活力測定方法：根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)局發(fā)布的方法進(jìn)行（GB8275-2009）。

2.酶活力定義：1mL酶液于60℃，pH 6.0條件下，1h液化1g可溶性淀粉為1個酶活力單位。

3.測定α-淀粉酶活性的可溶性淀粉和標(biāo)準(zhǔn)糊精液，應(yīng)做到當(dāng)天使用當(dāng)天配制，并注意防腐和冰箱低溫保存。

實(shí)驗11-4　葡萄糖淀粉酶的發(fā)酵與活力測定

（一）實(shí)驗?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵方法。

2.學(xué)習(xí)菲林試劑法測定葡萄糖淀粉酶活力的方法。

（二）實(shí)驗原理

葡萄糖淀粉酶工業(yè)上常稱為糖化酶。根霉、曲霉等霉菌中含有的糖化酶能將淀粉質(zhì)水解為葡萄糖，進(jìn)而被微生物利用。糖化酶活力的高低，往往決定著淀粉的利用率高低。

葡萄糖淀粉酶又稱γ-淀粉酶，作用于淀粉時，從非還原端開始逐次切下一個葡萄糖分子，它不僅能分解α-1，4-糖苷鍵，而且能分解α-1，6-糖苷鍵（但速度慢得多）。因此，葡萄糖淀粉酶能將直鏈淀粉和支鏈淀粉全部水解為葡萄糖。

（三）實(shí)驗材料

1.菌種：黃曲霉（Aspergillus f lavus）CICC 2410，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

2.原料：麩皮。

3.主要設(shè)備：超凈工作臺、滅菌器、三角瓶、培養(yǎng)箱。

4.試劑

（1）費(fèi)林試劑：

甲液：稱取15g硫酸銅（CuSO4·5H2O），0.05g次甲基藍(lán)，用水溶解并稀釋至1000mL。

乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉，54g氫氧化鈉，4g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至1000mL。

（2）0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取1g無水葡萄糖（預(yù)先于100～105℃烘干），用水溶解，加5mL濃鹽酸，用水定容至1000mL。

（3）pH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液

2M乙酸溶液：量取118mL冰乙酸，加水稀釋至1000mL。

2M乙酸鈉溶液：稱取272g乙酸鈉（CH3COONa·3H2O），用水溶解并稀釋至1000mL。

pH4.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液：將2M乙酸溶液和2M乙酸鈉溶液等體積混合。

（4）0.1N氧氧化鈉溶液：稱取4g氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至1000mL。

（5）2%可溶性淀粉溶液：準(zhǔn)確稱取2g可溶性淀粉（預(yù)先于100～105℃烘干），加少量水調(diào)勻，傾入80mL沸水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后用水定容至100mL。

（四）實(shí)驗方法與步驟

1.黃曲霉發(fā)酵

在250mL三角瓶中加麩皮5g，水10mL，于121℃滅菌20min，冷卻后接入黃曲霉孢子，搖勻，使孢子分散。30℃培養(yǎng)2d，菌絲布滿表面，將麩皮搖拌，接觸空氣，再培養(yǎng)2～3d。傾出，鋪在紙上，置于鼓風(fēng)干燥箱中低溫干燥，得風(fēng)干麩曲。

2.待測酶液的制備

稱取5.0g酶粉（預(yù)先培養(yǎng)好的含葡萄糖淀粉酶的固體曲）（以絕干計），置入250mL燒杯中，加90mL水和10mLpH 4.6乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，攪勻，于30℃水浴中保溫浸取0.5h，每隔15min攪拌一次。用脫脂棉過濾，濾液待測酶液。

3.酶活力測定

（1）糖化液的制備：吸取25mL2%可溶性淀粉溶液，置入50mL容量瓶中，于30℃水浴預(yù)熱10min。準(zhǔn)確加入5mL待測酶液，搖勻，立即計下時間，于30℃水浴準(zhǔn)確保溫糖化1h。迅速加入15mL0.1N氫氧化鈉溶液，終止酶解反應(yīng)。冷卻至室溫，用水定容至刻度。

同時做一空白液：吸取25mL2%可溶性淀粉溶液，置入50mL容量瓶中，先加入15mL0.1N氫氧化鈉溶液，然后準(zhǔn)確加入5mL待測酶液，用水定容至刻度。

（2）定糖

空白液測定：吸取費(fèi)林試劑甲、乙液各5mL，置入100～150mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入5mL空白液，并用滴定管預(yù)先加入適量的0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，使后滴定時消耗0.1%葡萄糖溶液在1mL以內(nèi)，搖勻，于電爐上加熱至沸，立即用0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定至藍(lán)色消失，此滴定操作須在1min內(nèi)完成。

糖化液測定：準(zhǔn)確吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。

（3）酶活力計算

酶粉糖化酶活力定義：1g絕干酶粉，在30℃，pH 4.6，1h內(nèi)水解可溶性淀粉為葡萄糖的克數(shù)。

式中：V0—加5mL空白液時10mL菲林試劑消耗0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；

　V—加5mL糖化液時10mL菲林試劑消耗0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；

　W—酶粉稱取量，5.0g，以絕干計；

　1000—g換算成mg。

（五）實(shí)驗結(jié)果與分析

在不同的培養(yǎng)時間取樣測定酶活力，記錄糖化酶隨發(fā)酵時間的變化情況。

（六）實(shí)驗注意事項

1.糖化溫度對糖化酶活力影響很大，故糖化溫度應(yīng)嚴(yán)格控制。

2.糖化酶活力與可溶性淀粉的質(zhì)量有關(guān)，故活力表示時應(yīng)予以注明可溶性淀粉的出廠。

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（編者：楊海龍）