Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)指出，雙螺旋的每一條DNA鏈都可以作為模板合成一條與其互補(bǔ)的DNA鏈，從而形成兩條與其完全相同的子鏈（圖3-1）。但是有兩個(gè)問題他們?cè)诋?dāng)時(shí)尚無法回答：①在復(fù)制過程中DNA雙螺旋如何解旋將雙鏈打開；②在復(fù)制過程中DNA的兩條鏈?zhǔn)欠裢瑫r(shí)作為模板復(fù)制子鏈。1958年Matthew Meselson和Franklin Stahl通過實(shí)驗(yàn)對(duì)后一個(gè)問題給予了一個(gè)滿意的解答，而人們對(duì)第一個(gè)問題的真正了解卻是在拓?fù)洚悩?gòu)酶的發(fā)現(xiàn)之后。

（一）DNA雙鏈的解旋

根據(jù)Watson和Crick的DNA雙螺旋模型以及他們對(duì)DNA作為復(fù)制模版的推測(cè)，人們首先提出的問題是：DNA分子只有在松弛螺旋、解開雙鏈、使堿基暴露后，才能在DNA聚合酶催化下以DNA為模板按堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行復(fù)制。那么，在復(fù)制過程中DNA雙螺旋如何解旋將雙鏈打開？按照每10個(gè)堿基一個(gè)螺旋推測(cè)，僅僅一條人的染色體DNA就有幾百萬甚至幾千萬次螺旋。很難想象在DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)這些螺旋如何打開。為此人們?cè)谧畛跎踔翆?duì)DNA雙螺旋的模型發(fā)生質(zhì)疑。1954年Delbrück首次提出“斷裂-連接”模型（breakage-and-reunion model），試圖解釋DNA雙螺旋的解旋過程。但是直到20世紀(jì)70年代末拓?fù)洚悩?gòu)酶被發(fā)現(xiàn)之后，人們才對(duì)這一過程具有了真正的了解。目前已知參與松弛螺旋及解鏈的酶與蛋白質(zhì)主要有拓?fù)洚悩?gòu)酶、解鏈酶及DNA單鏈結(jié)合蛋白。

1．拓?fù)洚悩?gòu)酶 DNA具有拓?fù)湫再|(zhì)。拓?fù)湫再|(zhì)是指物體或圖像作彈性移動(dòng)而又保持物體不變的性質(zhì)。堿基順序相同但連環(huán)數(shù)／拓?fù)洵h(huán)繞數(shù)不同的兩個(gè)雙鏈DNA分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體。能催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體互變的一類酶稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase，topo）。拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為兩類，一類是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（TopoⅠ）（圖3-2，圖3-3），另一類是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）。

（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ：原核生物TopoⅠ能使負(fù)超螺旋松弛。其作用機(jī)制是：①切斷DNA雙螺旋中的一股，酶與DNA斷端結(jié)合形成磷酸酪氨酸鍵；②互補(bǔ)鏈通過缺口；③斷端連接，使雙股的單環(huán)DNA轉(zhuǎn)變成松弛的雙鏈環(huán)。作用結(jié)果使分子內(nèi)張力釋放，DNA解鏈旋轉(zhuǎn)時(shí)不至于纏結(jié)。TopoⅠ催化的反應(yīng)不需要ATP。

（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ：TopoⅡ又稱解旋酶（gyrase），有兩個(gè)a亞基和兩個(gè)b亞基。a亞基具有磷酸二酯酶活性，b亞基具有DNA依賴的ATP酶活性。TopoⅡ在無ATP時(shí)，切斷處于超螺旋狀態(tài)DNA分子某一部位的兩條鏈，未斷的DNA雙鏈穿過缺口，使超螺旋松弛；有ATP時(shí)，水解ATP提供能量，已松弛的DNA分子轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋，增加超螺旋的穩(wěn)定性。此外TopoⅡ還具有環(huán)連或解環(huán)連，以及打結(jié)和解結(jié)的作用。

2．DNA解鏈酶（DNA helicase） 其作用是解開DNA雙鏈，需要有ATP為能源。解鏈酶有多種，包括大腸埃希菌解鏈酶Ⅱ、Ⅲ，大腸埃希菌Rep蛋白等。復(fù)制時(shí)大部分解鏈酶可以沿著隨從鏈的模板以5′→3′方向隨復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，并連續(xù)地解開DNA雙鏈。只有Rep蛋白是沿著前導(dǎo)鏈的模板以3′→5′移動(dòng)。Rep蛋白在初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱為復(fù)制蛋白R(shí)ep，后來發(fā)現(xiàn)它在有ATP存在時(shí)能解開DNA雙鏈，每解開一對(duì)堿基，需消耗兩分子ATP，因而又定名為解鏈蛋白。在DNA復(fù)制時(shí)，Rep蛋白與某種解鏈蛋白分別在兩條DNA親鏈上協(xié)同作用，使DNA雙鏈得以解開。

圖3-1　Watson和Crick預(yù)測(cè)的DNA復(fù)制模型

親代雙螺旋的多聚核苷酸由黑色表示，都作為DNA新鏈（由淺色表示）合成的模板。這些新鏈同模板鏈以堿基配對(duì)的方式?jīng)Q定其序列。拓?fù)鋵W(xué)問題的產(chǎn)生是因?yàn)橛H代螺旋的兩條多聚核苷酸鏈不能輕易地被拉開；螺旋必須通過某種方式來解旋

圖3-2　拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ作用模式

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ在DNA分子的一條鏈上制造一個(gè)缺口，使完好的那條鏈通過缺口，然后修復(fù)缺口

圖3-3　DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶將雙螺旋解旋

復(fù)制過程中，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶將雙螺旋“解旋”，因此復(fù)制叉就可以沿分子繼續(xù)前進(jìn)而不需要轉(zhuǎn)動(dòng)螺旋

3．DNA單鏈結(jié)合蛋白（single strand DNA binding protein，SSB） 在原核和真核細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，它能與解鏈酶解開的DNA單鏈緊密結(jié)合，維持單鏈狀態(tài)，以利于其發(fā)揮模板作用。SSB還能與復(fù)制新生的DNA單鏈結(jié)合，以保護(hù)其免被核酸酶水解。SSB在復(fù)制過程中，可以循環(huán)利用，發(fā)揮其保護(hù)單鏈DNA的作用。

（二）DNA半保留復(fù)制

在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提出以后，關(guān)于DNA復(fù)制方式有幾種不同的推測(cè)（圖3-4）。一種是在上述的“斷裂-連接”模型的基礎(chǔ)之上提出的彌散式復(fù)制（dispersive replication）方式。Delbrück在試圖解釋DNA雙螺旋的解旋過程時(shí)提出了這一模型。但是根據(jù)這一模型推測(cè)出的DNA復(fù)制方式，得到一種非常復(fù)雜的結(jié)果：DNA的每一條子鏈的一部分由新合成的DNA組成，而另一部分由模板鏈組成。也有人把這種模式稱為混合性復(fù)制。

圖3-4　DNA復(fù)制的三種可能途徑

為清楚顯示，DNA分子使用梯狀而非雙螺旋表示

Watson及Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)，曾推測(cè)在DNA復(fù)制時(shí)，DNA雙鏈中的互補(bǔ)堿基之間的氫鍵斷裂，解開為兩條單鏈，每一條單鏈都可以作為模板，按堿基互補(bǔ)原則合成互補(bǔ)鏈。新合成的兩個(gè)DNA分子和親代DNA分子是完全一樣的。在子代分子中各有一條單鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制（semi-conservative replication）。對(duì)DNA復(fù)制方式的第三種推測(cè)是，仍然是以親代的每一條鏈為模板合成一條新鏈，但在組成兩個(gè)子代分子時(shí)，一個(gè)子代分子完全是親代的兩條舊鏈組成，而另一個(gè)子代分子則由新合成的兩條新鏈組成，這種方式稱為全保留復(fù)制（conservative replication）。

1957年，Meselson和Stahl通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了半保留復(fù)制的模式（圖3-5）。他們以大腸埃希菌作為實(shí)驗(yàn)材料。大腸埃希菌可以利用NH4Cl作為氮源合成DNA。把細(xì)菌放在以15 N標(biāo)記的NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)基（重培養(yǎng)基）中培養(yǎng)15代（每一代20～30min），分離出的DNA是含15 N的“重”DNA，然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含有14 N標(biāo)記的NH4Cl作為唯一氮源的培養(yǎng)基（輕培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，新合成的DNA將有14 N的摻入。在培養(yǎng)的不同時(shí)間收集細(xì)菌、提取DNA進(jìn)行CsCl密度梯度離心分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌在重培養(yǎng)基中生長繁殖時(shí)合成的（15 N）DNA顯示為一條重密度帶；轉(zhuǎn)入輕培養(yǎng)基中繁殖兩代，在第一代時(shí)得到一條中密度帶，提示其為（15 N14 N）DNA的雜交分子；在第二代時(shí)可見中密度帶和低密度帶兩個(gè)區(qū)帶，表明它們分別為（15 N14 N）DNA及（14 N14 N）DNA。隨著在輕培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶保持不變。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合半保留復(fù)制方式。證實(shí)第一代雜交分子確實(shí)是（15 N14 N）DNA，將雜交分子經(jīng)100℃加熱變性，再對(duì)變性前、后的DNA分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心。結(jié)果變性前為一條中密度帶，變性后則分為兩條帶，即重密度帶和輕密度帶。說明雜交分子中一條為15 N-DNA鏈，另一條為14 N-DNA鏈，進(jìn)一步證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制。

由于DNA分子中兩股單鏈有堿基互補(bǔ)的關(guān)系，所以由一股鏈可以確定其對(duì)應(yīng)鏈的堿基序列，遺傳信息按這種方式忠實(shí)地從親代傳給子代。

圖3-5　Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)

A．Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)操作：在含有15 NH4Cl（用氮的重同位素標(biāo)記的氯化銨）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸埃希菌。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)基中（含14 NH4Cl），分別在20min（一次細(xì)胞分裂）和40min（兩次細(xì)胞分裂）后取樣，并從樣品中提取DNA進(jìn)行密度梯度離心分析。20min后的DNA樣品具有相似的15 N、14 N的含量；而40min后的樣品就能看到兩條帶，一條相當(dāng)于14 N-15 N-DNA雜交帶，另一個(gè)DNA分子完全由14 N組成。B．根據(jù)DNA復(fù)制三種可能的方式所推測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。20min后所看到的帶形排除全保留復(fù)制方式。因?yàn)榘催@種理論，經(jīng)過一輪復(fù)制，應(yīng)該得到兩種不同的雙螺旋，一種只含有15 N，而另一種只含有14 N。20min后實(shí)際見到的14 N-15 NDNA雜交帶與彌散復(fù)制和半保留復(fù)制一致。但40min后所見到的兩條帶就只與半保留復(fù)制一致。而彌散復(fù)制在兩輪復(fù)制后仍應(yīng)生成14 N-15 N雜交分子，而半保留復(fù)制在這個(gè)階段所合成的分子包括兩個(gè)完全由14 N-DNA所組成的分子

（三）復(fù)制叉和DNA的半不連續(xù)復(fù)制

當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)雙螺旋鏈打開，新鏈沿著張開的模板生成，形成一種Y字形的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉（replication fork）。DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模粭l是5′→3′方向，另一條是3′→5′方向，兩條鏈都能作為模板合成新的互補(bǔ)鏈。DNA合成的方向似乎是一條為3′→5′，另一條是5′→3′。但是，生物體內(nèi)所有DNA聚合酶的催化方向都是5′→3′，在復(fù)制過程中DNA聚合酶以3′→5′方向的DNA模板鏈為模板，隨著復(fù)制叉移動(dòng)的方向，連續(xù)合成新的互補(bǔ)鏈，稱為前導(dǎo)鏈（leading strand）。但是DNA聚合酶不能隨著復(fù)制叉移動(dòng)方向合成另一條模板鏈的互補(bǔ)鏈。另一條模板鏈?zhǔn)侨绾魏铣傻哪兀?968年在美國的日本學(xué)者岡崎等用電子顯微鏡和放射自顯影技術(shù)，觀察到DNA復(fù)制過程中存在的不連續(xù)復(fù)制現(xiàn)象，提出了不連續(xù)復(fù)制模式，即以5′→3′方向模板鏈合成的互補(bǔ)鏈也是沿5′→3′方向延伸，但與復(fù)制叉的前進(jìn)方向相反，合成許多短的片段，這些片段稱為岡崎片段（Okazaki fragment）；DNA連接酶再將岡崎片段連接成完整的DNA鏈，稱為隨從鏈（lagging strand）。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以DNA的復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuous replication）。隨從鏈的合成要等待模板解開足夠長度才能開始，因此比前導(dǎo)鏈遲一些，所以兩條互補(bǔ)鏈的合成是不對(duì)稱進(jìn)行的。

在電子顯微鏡下和利用放射自顯影可以觀察到DNA復(fù)制過程中形成的類似于眼睛狀的結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制眼（replication eye）（圖3-6）。復(fù)制眼的兩端即復(fù)制叉。復(fù)制眼可以有一個(gè)復(fù)制叉，即單向復(fù)制（uni-directional replication），也可以有兩個(gè)復(fù)制叉，即雙向復(fù)制（bi-directional replication）。

（四）復(fù)制的基本過程

DNA復(fù)制大致分為3個(gè)階段，即復(fù)制的起始、DNA鏈的延長和復(fù)制的終止。DNA復(fù)制過程十分復(fù)雜，但基本上都包括：①DNA雙鏈解開；②RNA引物的合成；③DNA鏈的延長；④切除引物、填補(bǔ)缺口、連接相鄰DNA片段；⑤切除和修復(fù)錯(cuò)配堿基。原核生物與真核生物的DNA復(fù)制有所不同，將分別進(jìn)行介紹。