第二節(jié)　蛋白質(zhì)的分離與純化

蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有成千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù)，到目前為止，還沒有一個(gè)單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來，但對(duì)任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x提純程序，采取幾種方法聯(lián)合使用來獲取高純度的產(chǎn)品。

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法，如蛋白質(zhì)的鹽析、等電點(diǎn)沉淀法、低溫有機(jī)溶劑沉淀法等；根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離的方法，如電泳法、離子交換層析法（IEC）；根據(jù)不同配體特異性的分離方法，如親和層析法；根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小差別的分離方法，如透析與超濾、凝膠過濾層析法（GFC）等。其中透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開；超濾法是利用高壓力或離心力，使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。

上述分離方法中的凝膠過濾層析法、離子交換層析法、親和層析法均屬于層析法。層析法是利用待分析樣品各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異，如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力和分配系數(shù)等，使各組分以不同程度分布在互不相溶的兩相，即固定相和流動(dòng)相中，并以不同的速度移動(dòng)，最終彼此分開。固定相可以是固體、液體、或一種固體和一種液體的混合物，而流動(dòng)相可以是一種液體或一種氣體。

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)分離純化的技術(shù)也有不少發(fā)展，比如濁點(diǎn)萃取法（CPE）、置換色譜法、雙水相萃取法等。

一、凝膠過濾層析法（GFC）

凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，不論是天然的還是人工合成的凝膠，內(nèi)部都具有很細(xì)微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品加載于凝膠柱后，不同相對(duì)分子質(zhì)量大小、不同形狀的蛋白質(zhì)在網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的凝膠中行進(jìn)的速度不一，較大的分子不能通過孔道擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠體內(nèi)部，而與流動(dòng)相一起最先流出層析柱；小分子蛋白可完全滲入凝膠內(nèi)部，流速最慢；中等分子的蛋白將在固定相和流動(dòng)相中產(chǎn)生不同的分配。根據(jù)分子篩效應(yīng)，通過收集不同組分的分離液，可將不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的蛋白質(zhì)分離開來。

目前市場上有售的凝膠過濾介質(zhì)有：葡聚糖凝膠，如Sephadex；聚丙烯酰胺凝膠，如Bio－Gel P；瓊脂糖凝膠，如Sepharose、Superose、Bio－Gel A；以及由瓊脂糖和葡聚糖組成的復(fù)合凝膠。不同的凝膠均有不同孔徑的系列產(chǎn)品，可以根據(jù)欲分離樣品的相對(duì)分子質(zhì)量大小選擇合適的凝膠。一般相對(duì)分子質(zhì)量較小的生物分子，選用葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠，以前者應(yīng)用更為普遍；大相對(duì)分子質(zhì)量的生物分子選用瓊脂糖凝膠；中等相對(duì)分子質(zhì)量的，則幾種均可選擇，但因瓊脂糖比其他兩種機(jī)械強(qiáng)度好，故傾向于采用瓊脂糖凝膠的比較多。有時(shí)候并不知道樣品的相對(duì)分子質(zhì)量范圍，此時(shí)只能先試用某種凝膠，再考慮是否選擇分離效果更好的。

二、離子交換層析法（IEC）

利用所分離物質(zhì)的陰、陽離子和相對(duì)應(yīng)的離子交換劑之間的靜電結(jié)合，根據(jù)物質(zhì)酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附和脫吸附而將電解質(zhì)各組分分開。由于電荷不同的各種物質(zhì)對(duì)離子交換劑有不同的親和力，通過改變洗脫液離子強(qiáng)度和pH，控制這種親和力，可使這些物質(zhì)按親和力大小的不同按順序依次洗脫。常用的離子交換劑有：離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖、離子交換瓊脂糖凝膠等。

生物大分子和離子交換劑之間的相互作用主要是靜電作用，導(dǎo)致介質(zhì)表面的可交換離子與帶相同電荷的蛋白質(zhì)分子發(fā)生交換。離子交換劑分為陰離子交換劑和陽離子交換劑兩大類。陰離子交換劑本身帶堿性基團(tuán)，在其pK以下荷正電，如果蛋白質(zhì)分子在高于其等電點(diǎn)的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，帶負(fù)電荷，則可與陰離子交換劑結(jié)合；陽離子交換劑本身帶酸性基團(tuán)，在其pK以上荷負(fù)電，如果蛋白質(zhì)分子在低于其等電點(diǎn)的pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，帶正電荷，則可與陽離子交換劑結(jié)合。

三、親和層析法（AC）

親和層析法是在一種特制的具有專一吸附力的吸附劑上所進(jìn)行的層析，是利用生物大分子和配基可逆親和結(jié)合的原理而達(dá)到不同組分分離的目的。比如酶與底物或抑制劑、抗原與抗體、激素與其受體等之間的可逆結(jié)合。親和層析是蛋白質(zhì)分離純化的一種重要的方法，具有很高的選擇和分離性能以及較大的載量。只需要一步處理即可使某種待分離的蛋白質(zhì)從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，達(dá)到千倍以上的純化，并保持較高的活性。目前親和層析技術(shù)被廣泛地應(yīng)用在蛋白質(zhì)研究和制備領(lǐng)域，是分離純化以及分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)的有力工具。

親和層析法中，配基的選擇是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。合適的配基在一定條件下應(yīng)能和欲分離的蛋白質(zhì)專一性結(jié)合，親和力越大越好；一定條件下又要能與已結(jié)合的蛋白質(zhì)解離，并且不破壞蛋白質(zhì)的生物活性。由于不同的蛋白質(zhì)選擇的配基不一樣，所以不同的蛋白質(zhì)分離時(shí)需要制備吸附有不同配基的層析柱，導(dǎo)致親和層析法的成本比較貴，但特異性好。

親和層析技術(shù)的一般步驟是：把待純化的某種蛋白質(zhì)的特異配體，通過化學(xué)反應(yīng)共價(jià)連接到載體表面的功能基上構(gòu)成配基。載體性能方面要允許蛋白質(zhì)自由通過。當(dāng)含有目的蛋白的混合樣品加到該配基上時(shí)，目的蛋白即和其特異性的配體結(jié)合而吸附在配基表面，而其他雜蛋白則被洗出。被特異地結(jié)合在配基上的目的蛋白質(zhì)可用自由配體分子或通過改變緩沖液的條件使之解吸附，并進(jìn)一步收集。

（高紅陽）

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