五、急性毒性試驗(yàn)方法

1.半數(shù)致死量（LD₅₀）的測(cè)定

最小致死量是使動(dòng)物剛好致死的藥物劑量，但由于藥物的性質(zhì)、給藥方法和個(gè)體差異，每只動(dòng)物的最小致死量有很大的差異。實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理表明，一群動(dòng)物最小致死量的平均值相當(dāng)于半數(shù)致死量。半數(shù)致死量測(cè)定方法很多，但實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)大同小異，所不同者為計(jì)算方法的不同，其試驗(yàn)方法如下：

（1）預(yù)試驗(yàn)：目的是找到一個(gè)零死亡的最大劑量和100%死亡最小劑量的估計(jì)值以決定實(shí)驗(yàn)中采用的最大劑量（Dm）和最小劑量（Dn）。這在LD₅₀測(cè)定中非常重要，是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵?？捎么菩曰蛐坌詣?dòng)物，設(shè)四組以上，每組3～4只，先用1∶10的劑量比給藥（如5、50、500和5000mg／kg的固定劑量）。觀察7d，記錄死亡動(dòng)物數(shù)。然后在死亡數(shù)4／4和0／4兩組之間按1∶2（如50、100、200和400mg／kg）以下的劑量比進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以此測(cè)得近似的0和100%死亡率。

（2）正式試驗(yàn)：在預(yù)試驗(yàn)Dn和Dm劑量范圍內(nèi)按等比設(shè)三個(gè)以劑量組，其組間劑量的比值一般在1∶0.6～1∶0.9范圍內(nèi)。購(gòu)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前應(yīng)馴化1周，隨機(jī)或按體重分組，每組10只以上，雌雄各半，分別編號(hào)，給藥前應(yīng)禁食（不禁水）過(guò)夜。各給藥組和溶劑對(duì)照組按體重給藥后，試驗(yàn)當(dāng)日多次觀察，第二日至最后一日每日觀察二次以上并及時(shí)詳細(xì)記錄毒性反應(yīng)癥狀，癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間，死亡時(shí)間等，第七日全部動(dòng)物測(cè)量體重處死并解剖，肉眼觀察病變情況。有毒性反應(yīng)、體重減輕或臟器有病變的動(dòng)物應(yīng)在剖檢后立即進(jìn)行主要臟器的病理組織學(xué)觀察。

LD₅₀和最小致死量及其可信限的計(jì)算可采用Bliss法、簡(jiǎn)化幾率法、改進(jìn)寇氏法、點(diǎn)斜法或其他LD₅₀的計(jì)算方法。計(jì)算結(jié)果對(duì)比表明，不同的計(jì)算方法，計(jì)算結(jié)果間一般無(wú)明顯差異，而不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一樣品試驗(yàn)結(jié)果常見(jiàn)有顯著差異。因此，采用較簡(jiǎn)單的計(jì)算方法完全可以滿足LD₅₀計(jì)算的準(zhǔn)確性。

2.最大給藥量試驗(yàn)

如因受試藥物的濃度或體積限制，無(wú)法測(cè)出LD₅₀時(shí)，可做最大給藥量試驗(yàn)。試驗(yàn)選用擬推薦臨床試驗(yàn)的給藥途徑，以動(dòng)物能耐受的最大濃度（試驗(yàn)溶液仍有較好的流動(dòng)性）最大體積的給藥量1次或1d內(nèi)2～3次給予動(dòng)物，以小鼠口服為例，動(dòng)物數(shù)不得少于20只，雌雄各半，口服容量一次不超過(guò)40mL／kg（體重），多次給藥間隔時(shí)間不低于4h，觀察7d，記錄毒性反應(yīng)和體重變化。如仍未見(jiàn)毒性反應(yīng)或體重正常增加，則可認(rèn)為該藥物小鼠口服最大給藥量未見(jiàn)毒性反應(yīng)，或LD₅₀大于該最大給藥量。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，該劑量甚至不可能大于LD14（P＝0.05）。如用10只動(dòng)物未見(jiàn)毒性反應(yīng)或死亡則該劑量不可能大于LD26（P＝0.05）。

3.LD₅₀測(cè)定舉例

（1）孫氏綜合法（點(diǎn)斜法）：從苦參中提取分離出一種生物堿單體，經(jīng)鑒定為苦參堿，現(xiàn)測(cè)定其對(duì)小鼠的急性毒性。

預(yù)試驗(yàn)：設(shè)200、150、100、50和25mg／kg五個(gè)劑量組，每組處理試鼠10只。將樣品配制成不同濃度，采用灌胃法一次性給藥，然后正常喂養(yǎng)7d，觀察試鼠的反應(yīng)及死亡情況。結(jié)果，劑量在200mg／kg時(shí)，試鼠在16h內(nèi)全部死亡，劑量100mg／kg時(shí)，試驗(yàn)期內(nèi)試鼠死亡8只，劑量50mg／kg時(shí)，在試驗(yàn)期試鼠死亡3只，劑量25mg／kg時(shí)，在試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)試鼠的死亡。由此得出Dm約為120mg／kg，Dn約為30mg／kg。

正式試驗(yàn)：Dm取100mg／kg，組間按八折等比排列，分五組，每組處理試鼠10只，按預(yù)試驗(yàn)的方法，采用灌胃法一次性給藥進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)束后將試驗(yàn)結(jié)果的原始數(shù)據(jù)和計(jì)算資料列成表，見(jiàn)表3-6。

表3-6　苦參堿對(duì)小鼠的LD₅₀測(cè)試原始數(shù)據(jù)和計(jì)算資料

上表內(nèi)：Dm——估計(jì)最大致死量；Xm——Dm的對(duì)數(shù)值；n——每組動(dòng)物數(shù)；K——組數(shù)；i——組間劑量比例的對(duì)數(shù)；Yh——高半組Y值的均數(shù)；Yc——低半組Y值的均數(shù)；R——Yh與Yc間的組距數(shù)。

按表內(nèi)數(shù)據(jù)，可按公式算出苦參堿LD₅₀有關(guān)的全部數(shù)據(jù)。

即苦參堿對(duì)試鼠的致死中量為64.00mg／kg。

②LD₅₀的標(biāo)準(zhǔn)誤

③LD₅₀的95%平均可信限

④回歸線斜率

⑤回歸方程

結(jié)論：

本例苦參堿對(duì)小鼠的LD₅₀＝64.00mg／kg；

LD₅₀的95%平均可信限＝64.00±9.26mg／kg

回歸方程：Y＝4.2402x－2.6578

上面公式中，幾率單位（Y）可根據(jù)試驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的死亡率由下表（表3－7）查出。

表3-7　死亡率與幾率單位互換表

（2）Dixon序貫法（上下法或稱階梯法）：

首先要預(yù)先擬定好4～8檔劑量組，按等比級(jí)數(shù)安排劑量。并按下表的樣子準(zhǔn)備好表格。實(shí)驗(yàn)從大劑量開(kāi)始，給藥后，如發(fā)生死亡，在表中以“×”記錄，下一只動(dòng)物降低一擋劑量給藥，如存活用“Δ”表示，下一只動(dòng)物則升高一擋劑量給藥，依次進(jìn)行到最后一只動(dòng)物。以第一次變號(hào)的前一個(gè)動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始。動(dòng)物數(shù)應(yīng)事先定好，一般用20～30只即可獲得較滿意的結(jié)果。

本法的優(yōu)點(diǎn)是用的動(dòng)物少，方法簡(jiǎn)便，比較節(jié)省，適用于毒性出現(xiàn)迅速的藥物；但不用于毒性出現(xiàn)緩慢的藥物。例如，煙堿對(duì)小鼠的毒性測(cè)定，方法及結(jié)果處理如下。

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)設(shè)定下表中四檔劑量，按灌胃法一次性給藥，共用試鼠28只。給藥后的結(jié)果（存活或死亡）填如下表內(nèi)（表3-8）。

表3-8　煙堿灌胃法對(duì)小鼠的LD₅₀序貫法測(cè)定結(jié)果列表單位：mg／kg

根據(jù)表3-5的實(shí)驗(yàn)記錄結(jié)果，整理實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表（表3-9）。

表3-9　煙堿灌胃法對(duì)小鼠的LD₅₀序貫法測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果整理

i＝0.0457 12 －9 21

（N）（A）（B）

計(jì)算：下式中，表內(nèi)反應(yīng)數(shù)以“Δ”計(jì)＋0.5，以“×”計(jì)－0.5。

標(biāo)準(zhǔn)誤

LD₅₀的95%平均可信