綜合實(shí)驗(yàn)六　味精制備技術(shù)

一、背景知識

（一）味精簡介

味精［Sodium（2S）-2-amino-5-hydroxy-5-oxo-pentanoate］又稱味素，是調(diào)味料的一種，主要成分為谷氨酸鈉。成品為白色柱狀結(jié)晶體或結(jié)晶性粉末，是國內(nèi)外廣泛使用的增鮮調(diào)味品之一。

味精是采用微生物發(fā)酵的方法由糧食制成的現(xiàn)代調(diào)味品。

（二）主要成分

谷氨酸鈉是一種氨基酸谷氨酸的鈉鹽，是一種無色無味的晶體，在232℃時(shí)解體熔化。谷氨酸鈉的水溶性很好，在100mL水中可以溶解74g谷氨酸鈉。

味精于1909年被日本味之素（味の素）公司所發(fā)現(xiàn)并申請專利。純的味精外觀為一種白色晶體狀粉末。當(dāng)味精溶于水（或唾液）時(shí)，它會迅速電離為自由的鈉離子和谷氨酸鹽離子（谷氨酸鹽離子是谷氨酸的陰離子，谷氨酸則是一種天然氨基酸）。

（三）鮮味

味精通過刺激舌頭味蕾上特定的味覺受體，比如說氨基酸受體T1R1/T1R3或谷氨酸受體，如：代謝性谷氨酸受體（mgluR4和mgluR1）以帶給人味覺感受。這種味覺被日本人定義為鮮味，但是這種日式的鮮味和中國人熟知的五味中的鮮味有明顯的區(qū)別。

（四）營養(yǎng)成分

營養(yǎng)素含量（每100g）熱量（大卡）268.00，碳水化合物（g）26.50，脂肪（g）0.20，蛋白質(zhì)（g）40.10，硫胺素（mg）0.08，煙酸（mg）0.30，鎂（mg）7.00，鈣（mg）100.00，鐵（mg）1.20，鋅（mg）0.31，銅（mg）0.12，錳（mg）0.67，鉀（mg）4.00，磷（mg）4.00，鈉（mg）8160.00（因味精為谷氨酸鈉，所以鈉含量最高），硒（μg）0.98。

二、實(shí)驗(yàn)簡介

本實(shí)驗(yàn)選用谷氨酸發(fā)酵作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，主要考慮谷氨酸發(fā)酵為典型的代謝調(diào)控發(fā)酵，對其代謝途徑和機(jī)制研究得較為透徹，可以讓學(xué)生們用掌握的微生物和生物化學(xué)知識來理解、解釋、預(yù)測發(fā)酵后的現(xiàn)象；其次，32h的發(fā)酵周期比較便于教學(xué)安排；同時(shí)，從培養(yǎng)基配制到味精原粉制備，是一個(gè)完整的綜合性實(shí)訓(xùn)實(shí)驗(yàn)體系，通過這部分內(nèi)容的學(xué)習(xí)和實(shí)踐，使學(xué)生充分了解味精生產(chǎn)的完整工藝過程，可為學(xué)生今后從事氨基酸生產(chǎn)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)6-1　谷氨酸發(fā)酵技術(shù)

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

谷氨酸是最先成功地利用發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)的氨基酸。谷氨酸發(fā)酵是典型的代謝調(diào)控發(fā)酵，其代謝途徑相對研究得比較清楚。因此，了解谷氨酸發(fā)酵機(jī)制，掌握其發(fā)酵工藝，將有助于對代謝調(diào)控發(fā)酵的理解，有助于對其他通風(fēng)發(fā)酵的理解和掌握，也有助于對已掌握的生化、微生物知識的融會貫通。

通過本次實(shí)驗(yàn)，掌握通風(fēng)發(fā)酵的一般工藝，熟練掌握通用機(jī)械攪拌罐的設(shè)備使用。增強(qiáng)學(xué)生對谷氨酸生產(chǎn)的感性認(rèn)識，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐動手能力。

（二）實(shí)驗(yàn)原理

目前工業(yè)上應(yīng)用的谷氨酸產(chǎn)生菌有谷氨酸棒狀桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、散枝短桿菌、黃色短桿菌、噬氨短桿菌等。我國常用的菌種有北京棒狀桿菌、純齒棒狀桿菌等。谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經(jīng)糖酵解（EMP途徑）和己糖磷酸支路（HMP途徑）生成丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶A（乙酰Co A），然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH＋4存在的條件下，生成谷氨酸。當(dāng)生物素缺乏時(shí)，菌種生長十分緩慢；當(dāng)生物素過量時(shí)，則轉(zhuǎn)為乳酸發(fā)酵。因此，一般將生物素控制在亞適量條件下，才能得到高產(chǎn)量的谷氨酸。

谷氨酸的生物合成受機(jī)體內(nèi)復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控。影響谷氨酸發(fā)酵過程的參數(shù)有很多，谷氨酸發(fā)酵過程主要受種子質(zhì)量、培養(yǎng)基組成、溫度、pH值以及供氧速率等因素控制。提取谷氨酸常用的工藝為等電點(diǎn)法和離子交換法。

（三）實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種

谷氨酸生產(chǎn)菌可通過微生物研究所或發(fā)酵研究所選購。

2.主要設(shè)備

試管、角瓶、空培養(yǎng)皿、抽濾瓶、高壓滅菌鍋、搖床、培養(yǎng)箱、顯微鏡、10L發(fā)酵罐及控制系統(tǒng)、螺桿式空壓機(jī)（500t/M5n）、蠕動泵、水環(huán)式真空泵、恒溫?fù)u床、凈化工作臺、蒸汽發(fā)生器（45k W）、配料桶（10L）、攪拌機(jī)（50r/min）、旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、生化培養(yǎng)箱等。

3.主要材料

淀粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、尿素、玉米漿、糖蜜、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳、消泡劑等。

（四）實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.工藝流程

圖1-6-1　味精生產(chǎn)工藝流程示意圖

2.實(shí)驗(yàn)步驟

（1）菌種制備

菌種擴(kuò)培順序：斜面菌種→一級種子→二級種子。

①斜面種子的制備。

斜面培養(yǎng)基配方：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.0。

操作：按上述配方配制斜面培養(yǎng)基，加熱，將融化的培養(yǎng)基分裝到已消毒的空試管中，裝量約為1/5，0.1MPa，30min滅菌，冷卻至45℃攤成斜面。

檢查：將制備好的斜面培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24h，檢查無菌后備用。

接種：將試管原種上的菌苔接種到新制斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，制成斜面菌種。

②一級種子制備。

培養(yǎng)基配方：葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.1%，玉米漿2.5%～3.3%，硫酸亞鐵、硫酸錳各2×10-6（0.0002%），pH 7.0。

操作：用1000mL三角瓶裝200mL培養(yǎng)基，8層紗布封口，0.1MPa滅菌30min，冷卻后接入1/3支斜面菌苔，置搖床上30～32℃，轉(zhuǎn)速170～190r/min培養(yǎng)12h。

一級種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：種齡12h，A（560nm吸光度凈增值）＞0.5，RG（殘?zhí)牵?.5%以下，pH 6.4±0.1。

③二級種子的制備。

培養(yǎng)基配方：葡萄糖2.5%，尿素0.34%，磷酸氫二鉀0.16%，糖蜜1.16%，硫酸鎂0.043%，消泡劑0.086mL/L，硫酸亞鐵、硫酸錳各2×10-6（0.0002%），pH 7.0。

操作：配制方法同一級種子，0.1MPa滅菌10min，冷卻后接種，接種量為10%（200mL培養(yǎng)基中接入一級菌種20mL），搖床培養(yǎng)7～8h；

二級種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：種齡7～8h，pH 7.2，A560≥0.6，無菌檢查：陰性，噬菌體檢查：陰性。

④合并種子。

將每5瓶二級種子在無菌條件下合并在1000mL的抽濾瓶內(nèi)（抽濾瓶先經(jīng)0.1MPa 30min，空消），放入冰箱待用。

（2）噬菌體的檢測

用試驗(yàn)樣和敏感菌澆雙層平板，在菌體生長過程中，如樣品中有噬菌體，由于噬菌體的溶菌作用，會在平皿上留下透明的斑點(diǎn)（噬菌斑），通過噬菌斑的計(jì)數(shù)，即可評估噬菌體的污染程度。

①培養(yǎng)基配制。

底層平板培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0%，pH 7.0。

上層平板培養(yǎng)基：葡萄糖0.1%，蛋白胨1%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂0.7%，pH 7.0。

底層平板培養(yǎng)基和上層平板培養(yǎng)基分裝2個(gè)三角瓶，紗布牛皮紙封口后0.1MPa滅菌30min。

②倒平板。

底層培養(yǎng)基溶解后倒平板，冷卻凝固備用。

樣品采集：如要測定無菌空氣中的噬菌體樣，可將上述底層平皿暴露在排氣口30min。如測定液體樣，則在上述底層平皿中加入適當(dāng)稀釋的樣品1mL（無菌操作）。

取0.1mL谷氨酸生產(chǎn)菌菌液，加入上述已加樣的底層平板上，后加5mL融化后冷卻到45℃左右的上層培養(yǎng)基，混合均勻。待上層培養(yǎng)基冷卻凝固后，放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h。

③計(jì)數(shù)。

觀察并計(jì)數(shù)平板培養(yǎng)基上的噬菌斑，按照樣品的稀釋度（液體樣品）或空氣流量及暴露時(shí)間（氣體樣）計(jì)算污染的噬菌體濃度。

④計(jì)算。

（3）大腸桿菌（谷氨酸脫羧酶）酶粉的制備

谷氨酸脫羧酶是目前測定谷氨酸所必需的工具酶，酶法測定具有專一性高、反應(yīng)靈敏等特點(diǎn)，較少受其他因素的干擾。

①菌種的培養(yǎng)。

先將菌種E.coli-TS在傳代培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)24h。

斜面培養(yǎng)基配方：牛肉膏1.0%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，瓊脂1.7%，用50%氨水調(diào)pH 7.2，0.1MPa滅菌30min，擺成斜面。

②一級種子培養(yǎng)。

培養(yǎng)基配方：牛肉膏5.0%，蛋白胨1.0%，磷酸二氫鉀0.25%（分消），用50%氨水調(diào)pH 7.1，用1000mL三角瓶裝200mL，0.1MPa滅菌20min。

冷卻后接種，1支斜面接一瓶一級種。接種后在搖床上36℃培養(yǎng)24h。搖床轉(zhuǎn)速為170r/min。

③發(fā)酵培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基配方：牛肉膏2.0%，蛋白胨1.5%，葡萄糖0.1%，玉米漿粉0.1%，磷酸二氫鉀0.25%（分消），用50%氨水調(diào)pH 7.1。1000mL三角瓶裝200mL，0.1MPa滅菌20min。冷卻后接種，接種量5%，培養(yǎng)方式同上。

④收集菌體。

將搖瓶中的發(fā)酵液收集后，用冷卻離心機(jī)離心，收集菌體，菌體用蒸餾水洗兩次。

⑤制備冷凍干粉。

將菌體用少量蒸餾水制成菌懸液，加入10倍體積的冷凍丙酮（-18℃），攪拌均勻，真空抽濾，將濾下的菌體再用5倍冷凍丙酮攪拌均勻，真空抽濾。

將菌體加入5倍體積的冷凍乙醚（-18℃）脫水，抽濾后將菌粉放在干燥器內(nèi)，放入冰箱，2d后將菌粉過篩，測定酶活性。

（4）谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的配制

按工藝要求配制發(fā)酵培養(yǎng)基，10L發(fā)酵罐定容7L，50L發(fā)酵罐定容35L，實(shí)際配料時(shí)，定容到預(yù)定體積的75%左右（即10L發(fā)酵罐定容7.5L），另25%容積為蒸汽冷凝水和種子液預(yù)留。

①發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖13%，硫酸鎂0.06%，磷酸氫二鉀0.1%，糖蜜0.3%，MnSO4和FeSO4各2×10-6，氫氧化鉀0.04%，玉米漿粉0.125%，消泡劑0.01%，pH 7.0。實(shí)罐滅菌溫度為115℃，30min。

②流加液制備：尿素配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的溶液，裝在1000mL的三角瓶中，每一瓶裝800mL。分消備用。

③裝料：打開罐蓋上的加料口，將培養(yǎng)基原液加入發(fā)酵罐內(nèi)。擰緊加料口螺母（注意：不要擰得太緊，否則會損壞密封圈）。

（5）實(shí)消

為了減少冷凝水的產(chǎn)生，實(shí)消開始時(shí)，先打開進(jìn)夾套的蒸汽閥和夾套排水閥，并開啟攪拌。當(dāng)溫度升到90℃時(shí)，關(guān)閉夾套進(jìn)氣閥，開啟進(jìn)發(fā)酵罐內(nèi)的蒸汽閥進(jìn)行直接加熱，繼續(xù)升溫至工藝要求；升溫過程需勻速攪動培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基均勻升溫，同時(shí)有利于降低滅菌時(shí)的噪音；滅菌過程中，應(yīng)時(shí)刻注意罐壓，并控制在0.08MPa之內(nèi)，嚴(yán)禁超壓。罐壓的控制通過調(diào)節(jié)排氣閥來實(shí)現(xiàn)。

注意在升溫過程中不要開溫控儀開關(guān)，否則當(dāng)上、下限設(shè)定值設(shè)定在培養(yǎng)溫度時(shí)，冷卻水管中會自動通冷卻水，不僅會影響升溫速度、浪費(fèi)蒸汽，更重要的是會引起蒸汽冷凝水過多，產(chǎn)生培養(yǎng)液濃度變化。實(shí)消時(shí)間一般為5min。實(shí)消結(jié)束后，關(guān)閉進(jìn)氣閥，用冷卻水進(jìn)行冷卻。

當(dāng)蒸汽閥門關(guān)閉以及通冷卻水后，發(fā)酵罐的罐壓將迅速下降，當(dāng)罐內(nèi)壓力降至0.03MPa時(shí)，必須開啟空氣進(jìn)氣閥，使無菌空氣進(jìn)入發(fā)酵罐內(nèi)，使罐壓保持在0.03～0.05MPa；當(dāng)罐溫降至70℃以下時(shí)，調(diào)節(jié)攪拌電機(jī)的調(diào)速器，慢速攪拌培養(yǎng)基，加快冷卻速度；同時(shí)可稍開空氣進(jìn)氣閥，調(diào)節(jié)排氣閥，使罐壓保持在（0.03～0.05）MPa。

加初尿素：發(fā)酵液冷卻至40℃左右時(shí)，通過蠕動泵加第一次尿素，添加量為0.6%～1.0%（添加量按菌種的脲酶活性大小和菌體同化能力的大小而定）。

（6）接種

①火焰封口法。先緩慢將罐壓降低到0.01MPa，關(guān)小進(jìn)、排氣閥，在接種口上繞上酒精棉點(diǎn)燃，用鉗子逐步打開罐頂接種口，并將蓋放置在有75%酒精的培養(yǎng)皿內(nèi)，防止污染。將二級種子液在火焰封口下倒入發(fā)酵罐內(nèi)，蓋上接種閥，旋緊。

②壓差接種法。操作步驟：第一步，將罐頂流加口在火焰封口下連接到裝有菌種的抽濾瓶側(cè)口管道上；第二步，將發(fā)酵罐壓力加大到0.1MPa，打開流加口閥，使發(fā)酵罐和菌種瓶的壓力平衡后，關(guān)閉流加閥；第三步，打開發(fā)酵罐排氣閥，使發(fā)酵罐壓力下降到（0.01～0.02）MPa（不能降為0），關(guān)閉排氣閥，使發(fā)酵罐和菌種瓶間形成壓力差；第四步，打開流加口閥，依靠壓力差將菌種液壓入發(fā)酵罐；第五步，重復(fù)第二步到第四步的操作，直到將所有菌種都壓入發(fā)酵罐為止。注意：由于抽濾瓶帶壓作業(yè)，為安全起見，要選用優(yōu)質(zhì)的抽濾瓶，并在瓶外加上帆布瓶套，防止意外砸瓶傷人。

③流加接種法。操作步驟：實(shí)罐消毒時(shí)在流加口上套上相應(yīng)口徑的80～100cm長的蠕動泵專用硅膠管，并在另一頭用8層紗布包扎。在實(shí)消時(shí)一起消毒；接種時(shí)，將紗布解除，迅速將硅膠管插入菌種瓶中，瓶口仍用紗布封口；用蠕動泵將菌種液壓入發(fā)酵罐。

（7）發(fā)酵過程的控制

①發(fā)酵過程的溫度控制。谷氨酸發(fā)酵0～12h為長菌期，最適溫度在30～32℃，發(fā)酵12h后，進(jìn)入產(chǎn)酸期，控制溫度為34～36℃。由于發(fā)酵期代謝活躍，發(fā)酵罐要注意冷卻，防止溫度過高引起發(fā)酵遲緩。

②發(fā)酵過程中的pH控制。發(fā)酵過程中產(chǎn)物的積累導(dǎo)致pH下降，而氮源的流加（氨水、尿素）導(dǎo)致pH升高，發(fā)酵中，當(dāng)pH降到7.0～7.1時(shí)，應(yīng)及時(shí)流加氮源。

長菌期（0～12h）控制pH≤8.2（由尿素流加量、風(fēng)量和攪拌轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)）。

產(chǎn)酸期（12h以后）控制pH在7.1～7.2。

控制pH的手段主要有：控制風(fēng)量和控制流加氮源。

放罐：達(dá)到放罐標(biāo)準(zhǔn)后，及時(shí)放罐。

放罐標(biāo)準(zhǔn)：殘?zhí)窃?%以下且糖耗緩慢（＜0.15%/h）或殘?zhí)牵?.5%。

（8）發(fā)酵過程的分析

發(fā)酵過程中，按表1-6-1頻次測定、記錄下列指標(biāo)：pH，通風(fēng)量，還原糖，A560、溫度（1次/h）；谷氨酸（1次/4h），發(fā)酵12h起。

表1-6-1　谷氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)操作記錄

（9）谷氨酸提取與精制

①谷氨酸等電提取流程。

圖1-6-2　谷氨酸等電提取流程

②等電操作。

將放罐的發(fā)酵液先測定放罐體積、pH、谷氨酸含量和溫度，開始攪拌。若放罐的發(fā)酵液溫度高，應(yīng)先將發(fā)酵液冷卻到25～30℃，消除泡沫后開始調(diào)pH。用鹽酸調(diào)pH 5.0（視發(fā)酵液的谷氨酸含量高低而定）；

當(dāng)pH達(dá)到4.5時(shí)，應(yīng)放慢加酸速度，在此期間應(yīng)注意觀察晶核形成的情況，若觀察到有晶核形成，應(yīng)停止加酸，攪拌育晶2～4h。若發(fā)酵不正常，產(chǎn)酸低于4%，雖調(diào)pH到4.0，仍無晶核出現(xiàn)，遇到這種情況，可適當(dāng)將pH降至3.5～3.8；

攪拌2h，以利于晶核形成，或者適當(dāng)加一點(diǎn)晶種刺激起晶；

攪拌育晶2h后，繼續(xù)緩慢加酸，耗時(shí)4～6h，調(diào)pH至3.0～3.2，停酸復(fù)查pH，攪拌2h后開大冷卻水降溫，使溫度盡可能低；

達(dá)到等電點(diǎn)pH后，繼續(xù)攪拌16h以上，停止攪拌靜置沉淀4h，關(guān)閉冷卻水，吸去上層菌液，至近谷氨酸層面時(shí)，用真空將谷氨酸表層之菌體和細(xì)谷氨酸抽到另一容器里回收。取出底部谷氨酸，離心甩干。

③谷氨酸鈉的精制流程。（圖1-6-3）

圖1-6-3　谷氨酸鈉的精制流程

④谷氨酸鈉的精制操作。

濕谷氨酸：水∶純堿∶活性炭＝1∶2∶（0.3～0.34）∶0.01，T＝60℃，pH＝6.4（用試紙測）；在不銹鋼桶內(nèi)加入清水及活性炭升溫到65℃，開動攪拌（60r/min）；投入谷氨酸；緩慢、逐步加入碳酸鈉中和到pH 6.4（試紙），調(diào)整中和液濃度至21～23Be；加熱至65℃，繼續(xù)攪拌。

⑤谷氨酸鈉的濃縮結(jié)晶。

將澄清的脫色液（18～20Be/35℃）加入旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器（加料小于1/2），真空度要求在80k Pa以上，溫度小于70℃，濃縮至34～34.5Be/80℃，升溫到80℃放料。放料后冷卻，攪拌2～3h后開冷卻水溫度，降溫到比室溫高15℃。

分離：抽濾（工業(yè)濾布作介質(zhì)）。

烘干：鼓風(fēng)干燥箱（溫度小于60℃）干燥，即可得到味精原粉。

（五）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.菌種的污染，勢必導(dǎo)致發(fā)酵的失敗，輕者產(chǎn)酸量下降，嚴(yán)重的不積累產(chǎn)物，因此，在菌種制備的整個(gè)過程中，都要樹立牢固的無菌概念，工作力求細(xì)致、到位。

2.空消允許蒸汽直接進(jìn)入發(fā)酵罐，但同時(shí)必須注意要將夾套接通大氣，防止高溫產(chǎn)生的高壓將夾套擠破。蒸汽溫度高，當(dāng)心燙傷。

參考文獻(xiàn)

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（編者：蔣新龍）