（一）實(shí)驗(yàn)原理及目的

細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳播存在時(shí)間和空間的組合形式，始發(fā)于胞漿中某一局部的Ca2+躍升，以一種反復(fù)瞬變的方式在細(xì)胞中傳遞，稱為鈣震蕩（calcium oscillation）。在正常心肌細(xì)胞內(nèi)，胞核和胞漿均存在小幅度鈣震蕩。

鈣火花（calcium spark）是指細(xì)胞肌漿網(wǎng)上鈣釋放通道（RyR）自發(fā)開放或由單個(gè)L型鈣通道開放觸發(fā)引起的局部鈣釋放事件，是興奮-收縮耦聯(lián)的基本單位。其特點(diǎn)為局限在很?。s2μm）的亞細(xì)胞區(qū)域，不被轉(zhuǎn)導(dǎo)，可單個(gè)散在或成簇狀發(fā)放，亦可由鄰近部位觸發(fā)。

激光共聚焦技術(shù)能夠檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子震蕩和鈣火花的形成。

（二）主要實(shí)驗(yàn)材料

Fluo-3（1mg/ml儲(chǔ)存液）探針、腎小球系膜細(xì)胞、Hank’s液。

（三）實(shí)驗(yàn)流程

1.細(xì)胞在共聚焦專用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，生長(zhǎng)70%～80%融合。

2.細(xì)胞用Hank’s液洗3次。

3.將儲(chǔ)備的Fluo-3（1mmol/L）用Hanks液稀釋到終濃度7.5μmol/L。

4.置37℃的培養(yǎng)箱中孵育30min。

5.將染色后的樣品用PBS洗2次。

6.置于60倍油鏡觀察區(qū)域及層面，用共聚焦顯微鏡觀察Fluo-3染色的細(xì)胞的某一層面的熒光圖像。

7.鈣離子震蕩掃描　啟動(dòng)共聚焦顯微鏡，選擇488nm氬離子激光，選擇timecourse程序，設(shè)置掃描間隔時(shí)間（osec）（在此條件下時(shí)，F(xiàn)V1000共聚焦顯微鏡能夠進(jìn)行3幀/s的掃描）、掃描次數(shù)（300次）的掃描，儲(chǔ)存為oib的動(dòng)態(tài)文件。

8.鈣火花掃描　啟動(dòng)共聚焦顯微鏡，選擇488nm氬離子激光，選擇線掃描程序（推薦選擇直線，速度快，而且比較方便控制時(shí)間），在時(shí)間掃描上設(shè)定掃描次數(shù)如1000次，在最終圖像上選擇火花的區(qū)域，點(diǎn)擊序列分析（series analysis）進(jìn)行分析。

（四）典型舉例

我們?cè)谘芯堪麧{鈣調(diào)控規(guī)律的過程中，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的系膜細(xì)胞內(nèi)鈣離子有其特殊的運(yùn)動(dòng)形式——鈣火花、鈣波和鈣瞬變。在微觀上，動(dòng)態(tài)地觀察了鈣信號(hào)與系膜細(xì)胞收縮的關(guān)系，見圖1-37和圖1-38。

圖1-37　單個(gè)系膜細(xì)胞胞內(nèi)鈣火花線掃描圖像及軟件分析結(jié)果

圖1-38　單個(gè)系膜細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子震蕩及鈣火花、鈣波、鈣瞬變的圖像及分析結(jié)果

參考文獻(xiàn)

[1]Feng Z,Wei C,Chen X,et al.Essential role of Ca2+release channels in angiotensin II-induced Ca2+oscillations and mesangial cell contraction.Kidney Int,2006,70:130-138