（一）實驗目的和原理

活細胞線粒體中的脫氫酶能夠還原黃色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-苯基四氮唑[3-（4，5-dimethylthiazol-2yl）-2，5-diphenylterazoliμm bromide，MTT]為藍紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情況下與活細胞數(shù)成正比。由于甲臜的多少可通過酶標儀測定其在570nm處的吸收度（OD值）而得知，因此可根據(jù)OD值推測出活細胞的數(shù)目，了解細胞增殖的能力。

（二）實驗試劑

MTT、二甲基亞砜。

（三）實驗步驟（適用于貼壁細胞）

1.收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，分于96孔板，（0.2～1）×104個細胞/孔，細胞濃度可以調(diào)整。

2.置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細胞貼壁，鋪板24h后，用無血清培養(yǎng)液同步16～18h。

3.換上含血清的培養(yǎng)液后（200μl/孔），加入不同濃度的藥物（藥物要經(jīng)過適當處理，如溶解性、除菌等），時間依據(jù)實驗需要，觀察24h、48h、72h、96h等時間點。

4.小心吸去上清，PBS輕輕洗滌，離心后再次棄上清。

5.每孔加入100μl新鮮培養(yǎng)液，再加入10μlmTT溶液（5mg/ml，即0.5%mTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。

6.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

7.每孔加入100μl二甲基亞砜（DMSO），置溫箱中5～15min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm或570nm處（single3）測量各孔的吸光值。

8.同時設置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設定5復孔。

（四）注意事項與常見問題

1.實驗時應設置調(diào)零孔、對照孔、加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、二甲基亞砜，不同的是對照加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

2.每孔中的細胞數(shù)可以根據(jù)細胞生長的速度調(diào)整，并進行預實驗調(diào)整濃度，太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

3.貼壁細胞加MTT前吸掉培養(yǎng)液，懸浮細胞可以不吸除培養(yǎng)液，再加入0.5%mTT。96孔板量為20μl/孔。每100μl培養(yǎng)液加入10μl0.5%mTT。

4.如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過100μl，MTT按照10%的比例加入。

5.MTT一般4℃保存2周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20℃長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解，配制完后可過濾一下。

6.對于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值；而對于SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，并且建議以655nm作為參考波長。

7.96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大。對于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關培養(yǎng)箱的次數(shù)和時間。96孔板最外一圈孔一般不鋪細胞，加入PBS或培養(yǎng)液即可。

（五）典型結(jié)果

見圖1-50。

圖1-50　MTT法檢測不同時間點大鼠系膜細胞增殖能力

正義轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染了NaDC3；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）組：抑制NaDC3誘導的細胞肥大與衰老

參考文獻

[1]Zhuo L,Cai G,Liu F,et al.Expression and mechanism of mammalian target of rapamycin in agerelated renal cell senescence and organ aging.Mech Ageing Dev,2009,130:700-708.

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