四、染料結合比色法

（一）實驗目的

1．了解考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的基本原理。

2．掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度的基本實驗方法。

（二）實驗原理

當考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后，呈深藍色，最大吸收峰從465nm轉至595nm。在一定蛋白質濃度范圍內，595nm處的吸光度與蛋白質濃度成正比，據此可定量測定蛋白質濃度。

本方法靈敏度高，可測定1～10μg含量的蛋白質。

（三）實驗藥品、實驗設備

1．血清：人血清，用蒸餾水稀釋200倍；

2．考馬斯亮藍G-250（CBG）試劑：稱取l00mg考馬斯亮藍G-250，溶于50m195％乙醇中，并加入85％磷酸l00mL，再加蒸餾水至1000mL；

3．1g/L蛋白質標準液：準確稱取牛血清蛋白1mg，溶解在l mL蒸餾水中；

4．0.9％NaCl溶液；

5．分光光度計；

6．15mm×150mm試管；

7．刻度吸管；

8．試管架；

9．1000mL量筒。

（四）實驗方法

1．標準曲線制作

取6支大試管編號，按表2-15所示順序和劑量加入各試劑。

表2-15　染料結合比色法工作曲線

混勻，室溫靜置3min，用分光光度計在595nm波長下，以“0”管試液作參比液，讀取各管吸光度。

以各吸光度為縱坐標，各標準蛋白濃度為橫坐標，繪制吸光度-蛋白質濃度標準曲線。

2．血清測定

取兩支大試管編號，按表2-16所示順序和劑量加入各試劑，搖勻，室溫靜置3min，用分光光度計在595nm波長下，以空白管試液作參比液，讀取測定管吸光度。

表2-16　血清中蛋白質濃度的染料結合比色法測定

3．結果處理

根據測定管的吸光度從標準曲線上查得相應的蛋白質濃度，再乘以稀釋倍數即為血清中蛋白質的濃度。

4．注意事項

（1）干擾本法的因素很少，且染料與蛋白質結合反應快，顯色穩(wěn)定，可保持1h，重復性好。

（2）本法受蛋白質的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質的染色強度差異不大。

（3）樣品需要量少，一般只需50～100μL，且靈敏度極高。

（五）實驗記錄

1．標準曲線的繪制。

2．實驗記錄：

（六）思考題

1．試比較本法和其他蛋白質定量方法的優(yōu)缺點。

2．本法操作的關鍵是什么？

【注釋】

[1]*冰醋酸一般都含有乙醛酸雜質，故可用冰醋酸代替乙醛酸。