第二節(jié)　基因工程

上世紀(jì)90年代，美國(guó)上映了兩部科幻電影《侏羅紀(jì)公園》和《失落的世界》，在全世界范圍內(nèi)掀起了一股經(jīng)久不衰的恐龍熱。觀眾對(duì)作者非凡的科幻想象能力發(fā)出由衷的贊嘆，作者竟能想象從琥珀——史前樹(shù)液的石化樹(shù)脂中提取出遠(yuǎn)古時(shí)期吸血昆蟲肚子里的恐龍血，從中分離恐龍DNA(脫氧核糖核酸)，破譯恐龍的遺傳密碼，然后利用基因工程技術(shù)，人工無(wú)性繁殖出侏羅紀(jì)時(shí)期和白堊紀(jì)時(shí)期的恐龍。

贊嘆之余，許多人可能要問(wèn)了:什么是基因工程技術(shù)?為什么想象用基因工程技術(shù)繁殖恐龍?

基因(gene)是一段可以編碼，具有某種生物學(xué)功能物質(zhì)的核苷酸序列。基因工程(geneticengineering)是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，按照人類的需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后按設(shè)計(jì)方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA的重組技術(shù)，也就是基因克隆技術(shù)。重組，顧名思義，就是重新組合，即利用供體生物的遺傳物質(zhì)，或人工合成的基因，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶切割后與適當(dāng)?shù)妮d體連接起來(lái)形成重組DNA分子，然后再將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞或受體生物之中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物，該種生物就可以按人類事先設(shè)計(jì)好的藍(lán)圖表現(xiàn)出新的生物性狀。

基因工程一般包括四個(gè)步驟:一是取得符合人們要求的目的基因;二是將目的基因與質(zhì)粒或病毒DNA連接成重組DNA分子;三是把重組DNA引入某種細(xì)胞;四是把能表達(dá)目的基因的受體細(xì)胞挑選出來(lái)。由于基因工程是在分子水平上進(jìn)行操作，從而突破物種間的遺傳障礙，超越物種間的不親和性，創(chuàng)造出人們所需要的新品種。因此，科學(xué)家們可以利用基因工程實(shí)現(xiàn)人類對(duì)各種物種改良的愿望。比如，將一種生物的DNA中的某個(gè)遺傳密碼片段連接到另外一種生物的DNA鏈上去，將DNA重新組織一下，就可以按照人類的愿望，設(shè)計(jì)出新的遺傳物質(zhì)并創(chuàng)造出新的生物類型(如圖10－1)。

圖10－1　人源目的基因克隆至大腸桿菌的操作

這種做法就像技術(shù)科學(xué)的工程設(shè)計(jì)，按照人類的需要把來(lái)自某種生物的某個(gè)“基因”與另一生物的某個(gè)“基因”重新“施工”，“組裝”成新的基因組合，創(chuàng)造出新的生物。這種完全按照人的意愿，由重新組裝基因到新生物產(chǎn)生的生物科學(xué)技術(shù)，就稱為“基因工程”，或者說(shuō)是“遺傳工程”?；蚬こ叹哂袃蓚€(gè)重要特征:首先，外源DNA分子在不同的宿主生物中進(jìn)行繁殖，能夠跨越天然物種屏障，把來(lái)自其他生物的基因放置到新的生物中，而這種生物可以與原來(lái)生物毫無(wú)親緣關(guān)系，這種能力是基因工程的第一個(gè)重要特征。第二個(gè)特征是，一種確定的DNA小片段在新的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，這樣實(shí)現(xiàn)很少量DNA樣品復(fù)制出大量的DNA，而且是大量沒(méi)有污染任何其他DNA序列的、絕對(duì)純凈的DNA分子群體。

一、基因工程的工具酶

基因工程的操作是分子水平上的操作，它是依賴一些重要酶作為工具來(lái)對(duì)基因進(jìn)行切割和拼接等操作的，所以把這些酶稱為工具酶?；虻闹亟M與分離，涉及一系列相互關(guān)聯(lián)的酶催化反應(yīng)。已經(jīng)知道有許多種重要的工具酶(表10－2)，例如從核酸分子的末端開(kāi)始，一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸地消化降解多核苷酸鏈核酸外切酶、從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑蔚暮怂醿?nèi)切酶，以及以mRNA為模板合成互補(bǔ)鏈DNA的反轉(zhuǎn)錄酶等，在基因克隆的實(shí)驗(yàn)中都有著廣泛的用途。

表10－2　重組DNA實(shí)驗(yàn)中常用的工具酶

二、基因工程的載體

基因工程是要按人們的意愿去有目的地改造，創(chuàng)建生物遺傳性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分離或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要載體攜帶它們到合適的細(xì)胞中復(fù)制和表現(xiàn)功能?；蚩寺≥d體(gene cloning vector)就是指運(yùn)載外源DNA有效地進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。在體外，載體同外源DNA重組，DNA重組分子在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。

因此，對(duì)理想的基因工程載體一般至少有以下幾點(diǎn)要求:(1)具有在宿主細(xì)胞中進(jìn)行高效的自主復(fù)制的能力。(2)容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。(3)載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，使外來(lái)核酸片段易于插入。(4)容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)，這才便于重組操作。(5)具有利于選擇的標(biāo)記基因，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞，或攜帶著外來(lái)的核酸序列進(jìn)入宿主細(xì)胞，都能容易被辨認(rèn)和分離出來(lái)。

基因工程操作中最常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母人工染色體BAC、HAC和YAC等。質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。早期用于基因工程的載體是經(jīng)遺傳改良的細(xì)菌質(zhì)粒，它們僅能用于克隆分子量小于10kb的外源DNA片段。現(xiàn)在分子生物學(xué)使用的質(zhì)粒載體都已不是原來(lái)細(xì)菌或細(xì)胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過(guò)了許多的人工改造。從不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康某霭l(fā)，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種不同類型的質(zhì)粒載體，近年來(lái)發(fā)展很快，新的有特定用途的質(zhì)粒不斷被創(chuàng)建。噬菌體是感染細(xì)菌的一類病毒，利用λ噬菌體作載體，主要是將外來(lái)目的DNA替代或插入噬菌體DNA的非必需部分。利用λ噬菌體作載體可插入15kb～23kb的外源DNA片段。質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜，花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中，使載體及其攜帶的外來(lái)序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前常用的病毒載體有改造來(lái)自猴腎病毒SV40(Simian Virus40)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等。上述幾種載體都不能攜帶大于50kb的外源片段，而很多真核生物基因長(zhǎng)度在50kb以上，細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)載體就是為了克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計(jì)構(gòu)建的。

三、基因工程的步驟

1.目的基因的獲取

基因工程技術(shù)首先要獲取目的基因。所謂目的基因就是人們?cè)诨蚬こ滩僮鬟^(guò)程中所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。獲取目的基因的途徑是從生物中直接提取或人工合成，可以歸納為以下幾種:

(1)鳥槍法，這種方法類似于鳥槍發(fā)射散彈。具體的做法是:用若干個(gè)合適的限制酶處理一個(gè)DNA分子，將它切成若干個(gè)DNA片段。這些片段的長(zhǎng)度相當(dāng)于或略大于一個(gè)基因。然后，將這些不同的DNA片段分別與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，形成重組DNA，再將它導(dǎo)入到相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)菌中。最后，把這些細(xì)菌中的這段DNA分離出來(lái)。這種方法的缺點(diǎn)是專一性較差，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因。但由于這種方法操作簡(jiǎn)便，所以現(xiàn)在仍然廣泛采用。

(2)PCR法，是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。通過(guò)特異設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，實(shí)現(xiàn)在體外對(duì)目的基因的快速擴(kuò)增，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。

(3)反轉(zhuǎn)錄法，這種方法是在分離細(xì)胞總RNA的基礎(chǔ)之上實(shí)現(xiàn)的。以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成一個(gè)互補(bǔ)的DNA，即cDNA單鏈，再以此單鏈為模板合成出互補(bǔ)鏈，就成為雙鏈DNA分子。這種方法專一性強(qiáng)，但是操作過(guò)程比較麻煩，特別是mRNA很不穩(wěn)定，生存時(shí)間短，所以要求的技術(shù)條件較高。

(4)人工合成，這種方法主要是通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀，通過(guò)固相亞磷酸酰胺法合成。這種方法目前僅限于合成核苷酸對(duì)較少的一些簡(jiǎn)單基因，而且需要預(yù)先知道核苷酸序列。對(duì)于許多復(fù)雜的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用這種方法合成，只能用其他方法分離或合成。這種合成基因的方法還有一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物產(chǎn)生新的性狀以滿足人類需求。因此，這一方法今后將隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)而得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

2.目的基因與載體的連接

在通過(guò)不同的途徑獲取了目的基因，選擇或構(gòu)建適當(dāng)?shù)幕蜉d體之后的工作是如何將目的基因與載體連接在一起，即DNA的體外重組?；蛑亟M是基因工程的核心。載體DNA和目的基因的連接，按DNA片段末端性質(zhì)不同，可以有不同的連接方法，主要有粘末端DNA片段的連接和平末端DNA片段的連接。采用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的DNA片段;或用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái);或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly(dA)－poly(dT)尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái);又或者先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來(lái)。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點(diǎn)都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。

3.重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞及重組體的篩選與鑒定

外源基因與載體在體外連接成重組DNA分子后，需要將其導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和篩選，以期得到大量、單一的重組體分子，這就是外源基因的無(wú)性繁殖或稱克隆。由于外源基因與載體構(gòu)成的重組DNA分子性質(zhì)不同，宿主細(xì)胞不同，將重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞的具體方法也不相同。重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法，大體上可劃分為轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、微注射技術(shù)及基因槍技術(shù)等。

通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等導(dǎo)入方式，重組DNA分子被導(dǎo)入受體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)得到大量所需轉(zhuǎn)化子菌落或轉(zhuǎn)染噬菌斑。下一步需要將重組體的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞或轉(zhuǎn)染噬茵體群體從其他細(xì)胞群體中分離出來(lái)，并要鑒定克隆的外源基因確實(shí)為目的基因，這一過(guò)程即為篩選。

在基因工程上使用的所有載體分子，都帶有一個(gè)可選擇的遺傳標(biāo)記或表型特征。質(zhì)粒以及柯斯載體具有抗藥性記號(hào)(如四環(huán)素抗性和氨芐卡那霉素抗性)或營(yíng)養(yǎng)記號(hào)，而對(duì)于噬茵體來(lái)說(shuō)，噬茵斑的形成則是它們的自我選擇特征。根據(jù)載體分子所提供的遺傳特性進(jìn)行選擇，是獲得重組體DNA分子群體的必不可少的條件之一。這種遺傳選擇法，使我們能夠?qū)⒅亟M體的DNA分子同非重組體的親本載體分子區(qū)別開(kāi)來(lái)?？顾幮杂浱?hào)的插入失活作用，或者是諸如β－半乳糖苷酶基因一類的顯色反應(yīng)，便是屬于這種依據(jù)載體編碼的遺傳特性選擇重組體分子的典型方法