實驗四　脂類染色法

【實驗目的】

了解和掌握脂類染色的原理和操作方法。

【實驗原理】

脂肪主要存積于脂肪組織中，并以油滴狀的微粒存在于脂肪細胞漿內(nèi)。

在病理檢驗中，脂類染色法最常用于證明脂肪變性、脂肪栓子以及腫瘤的鑒別。脂類染色使用最廣泛的染料是蘇丹染料，最常用的有蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、蘇丹黑及油紅O等。脂肪被染色，實際上是蘇丹染料被脂肪溶解吸附而呈現(xiàn)染料的顏色。經(jīng)研究認為組織中脂質(zhì)在液態(tài)或半液態(tài)時，對蘇丹染料著色效果最好。根據(jù)這一原理，適當提高溫度(37～60℃)對組織切片染色效果是有好處的。

脂類染色實驗中一般用冰凍或石蠟切片，以水溶性封固劑封固，如甘油明膠和阿拉伯糖膠等。

脂類染色法在臨床上主要用于鑒別脂滴和糖元;觀察肝細胞、心、腎、骨骼肌細胞糖元的分布;鑒別橫紋肌瘤和顆粒細胞母細胞瘤，前者陽性，后者陰性;鑒別泡沫細胞瘤和卵巢纖維瘤，前者為陽性，后者為陰性;Fabry病(或稱安德森-法布里病)的診斷(Fabry病是一種α-連鎖先天性糖鞘脂代謝障礙，細胞漿物質(zhì)PAS和蘇丹黑染色呈強陽性反應(yīng))等。

【實驗器材】

冰凍切片機、載玻片、蓋玻片、染色缸等。

【藥品試劑】

1．10%甲醛、酒精、60%異丙醇。

2．蘇丹III、蘇丹IV混合液:蘇丹III 0．2 g，70%酒精50 ml;蘇丹IV0．5 g，丙酮50 ml。

3．蘇木素。

4．甘油明膠:甘油50 ml、蒸餾水50 ml、明膠10 g、酚0．5 ml。把明膠溶于蒸餾水，攪拌片刻，放入37℃的溫箱中過夜。第二天再加入甘油，加入酚防腐，然后存放于4℃冰箱中，用時取出，用熱水促其溶解即可使用。

5．油紅O染液:油紅O(oil red o)0．5 g，異丙醇100 ml。將異丙醇放入三角燒瓶，再加入油紅O，于水浴中慢慢加熱使之溶解，待完全溶解后取出，冷卻至室溫后，過濾，裝于棕色小磨砂口瓶保存，臨用前取6 ml加蒸餾水4 ml，混合后靜置10分鐘后過濾，染色時間5～15分鐘。

6．蘇丹黑B染液:蘇丹黑B(sudan blank B)0．5 g，70%酒精100 ml。取三角燒杯，裝入酒精，再加入蘇丹黑，在水浴中邊加熱邊攪拌，直至沸騰達2～3分鐘，取出待冷卻后過濾，溶液保存于小磨砂瓶中。

7．0．1%核固紅染料。

8．2．5%鐵明礬水溶液。

9．醋酸-硫酸混合液:取一容器，盛入冰塊或冰水，將10 ml冰醋酸裝于小瓶后置入冰塊中，再加入10 ml硫酸，混合后靜置數(shù)分鐘取出即可。

【實驗方法】

1．脂類組織的固定及固定液的選擇:脂類組織的固定特別要注意的問題，就是不要選擇含酒精的固定液，因為酒精可把脂類物質(zhì)溶解，因此，用于脂類物質(zhì)的首選固定液是甲醛，它可較好地保存脂類物質(zhì)。

2．蘇丹III蘇丹IV聯(lián)合法(combined SudanIII IV method for lipids):

(1)用經(jīng)過甲醛固定過的組織作冰凍切片，厚10～15μm，切完后放入蒸餾水中，染色前放入50%～70%酒精洗。

(2)放入蘇丹III蘇丹IV染液染5分鐘。

(3)70%酒精分化，水洗。

(4)蘇木素淺染細胞核。

(5)水洗。

(6)藍化，如為漂浮染色，此時應(yīng)將切片附貼于載片。

(7)甘油明膠封固。

結(jié)果:脂類物質(zhì)呈現(xiàn)橘紅色或鮮紅色，核藍色。蘇丹III染脂肪小顆粒時呈橘黃色，而蘇丹IV染脂肪小顆粒時呈紅色。

3．油紅法:

(1)福爾馬林固定后的恒冷箱切片附貼于載片上或游離切片，厚5～10μm。

(2)60%異丙醇稍洗切片。

(3)油紅O液染5～15分鐘。

(4)60%異丙醇洗去多余染液。

(5)自來水洗。

(6)蘇木素染細胞核2分鐘。

(7)自來水洗。

(8)水洗至細胞核藍化5～10分鐘。

(9)擦去多余水分，甘油明膠封固。

結(jié)果:脂類物質(zhì)顯示紅色，細胞核顯示藍色

4．蘇丹黑B法:

(1)福爾馬林固定的組織恒冷箱冰凍切片，附貼于載片上或收集于裝有蒸餾水的小燒杯中，厚5～10μm。

(2)50%～70%酒精稍洗切片。

(3)蘇丹黑B染液中染色5～15分鐘。

(4)50%～70%酒精洗去多余染液。

(5)蒸餾水洗。

(6)0．1%核固紅染細胞核10分鐘。

(7)自來水洗10分鐘。

(8)擦去切片上多余的水分。

(9)甘油明膠或水性封片劑封固。

結(jié)果:脂類物質(zhì):黑色，細胞核:紅色。

5．漂浮染色法:

(1)選用固定好的組織，用恒冷切片或二氧化碳等冰凍切片均可，切片厚度為5～10μm，收集于小燒杯中，內(nèi)裝有蒸餾水。

(2)用玻璃彎鉤將切片鉤出，于50%～70%的酒精中稍洗。

(3)將切片鉤入染液(上述三種方法中的任一種染液中)浸染5～10分鐘。

(4)于50%～70%酒精中洗去多余的染液。

(5)于蘇木素染液中染2分鐘。

(6)水洗5～10分鐘。

(7)挑選完整的切片，浸入50%～70%酒精中，然后放入水中，此時切片由于酒精中的張力，能將切片平整地裱于水的表面，取出載玻片，將切片撈于載玻片上，擦干周邊的水分，用甘油明膠或水性封固劑封固切片。

結(jié)果:依據(jù)選用的染色方法顯示出各自的結(jié)果。

6．Schultz法顯示膽固醇與膽固醇酯:

(1)組織固定于10%福爾馬林2天。

(2)沖洗組織，冰凍切片10～20μm。

(3)切片用蒸餾水稍洗。

(4)2．5%鐵明礬水溶液氧化切片2天或更長。

(5)蒸餾水洗。

(6)將切片撈于載玻片上，擦干四周水分，但勿令切片干燥。

(7)滴入反應(yīng)液于切片上并隨之蓋上蓋玻片。

結(jié)果:膽固醇和膽固醇酯呈綠色反應(yīng)，當反應(yīng)時間延長至30分鐘時，反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)樽睾稚?/p>

【注意事項】

1．凡用做脂類染色的組織不管是什么組織，都不能用含有酒精的固定液做固定，必須用福爾馬林或福爾馬林鈣等固定。

2．用做脂類染色的切片不能用石蠟切片，只能用各種冰凍切片。

3．做脂類染色時，最好是用漂浮染色技術(shù)，因該技術(shù)能使切片更加充分地染色，漂浮的切片對于脂類的保存更好。

4．在漂浮染色時，當切片從70%酒精移入水時由于酒精的關(guān)系導致切片表面張力而浮于水面，并發(fā)生打轉(zhuǎn)，如此切片發(fā)生碰撞而出現(xiàn)破裂的現(xiàn)象，影響切片的完整性。可以用玻璃鉤鉤住切片，小心慢慢地放入水中，不使其浮出水面，當切片上含有的酒精離去后，切片會沉入水中或沉入染液中。

5．切片封固時，不能烤干或令其自然干，應(yīng)在濕片的情況下封片。

6．如果切片出現(xiàn)過多的氣泡，不能強行將其壓出，應(yīng)將切片放入水中，退去蓋片，再行封片，如果將氣泡強行壓出，將有可能導致脂滴移位的危險。

7．染色時間，不應(yīng)千篇一律，應(yīng)視各種組織含有的脂類物質(zhì)而確定染色時間，

8．染液遇水易發(fā)生沉淀，染色時應(yīng)該盡量減少切片水分的含量，進入染液時切片應(yīng)盡量擦干水分。

9．配好的染液應(yīng)密封保存，減少與空氣的接觸，防止發(fā)生氧化或揮發(fā)而發(fā)生沉淀。

10．膽固醇和膽固醇酯顯示好壞，取決于切片氧化的程度，本法用2．5%的鐵明礬氧化2天或更長，如果在2天里的氧化效果不好，則可再延長氧化時間。

11．皮爾斯主張2．5%的鐵明礬用0．2 mol/L醋酸鹽緩沖液來配制，且于37℃處理7天。

12．配制醋酸和硫酸混合液，純度要求較高，應(yīng)用分析純以上，如純度較低，雜質(zhì)含量較高，混合時可產(chǎn)生大量的氣泡，影響觀察。