科學(xué)家們對(duì)于突觸前特異化部位的快速遞質(zhì)釋放、釋放的時(shí)間順序以及參與的分子，已經(jīng)有了相當(dāng)清楚的了解?；仡^看看神經(jīng)肽，多數(shù)神經(jīng)肽從非突觸部位釋放，與快速神經(jīng)遞質(zhì)的釋放相比較，它受到的關(guān)心較少。神經(jīng)肽從DCV釋放，可能需要調(diào)節(jié)小泡運(yùn)輸和釋放的獨(dú)特蛋白質(zhì)。樹(shù)突的神經(jīng)肽釋放是一個(gè)特點(diǎn)，它的生理學(xué)意義和機(jī)制都是值得很好關(guān)心的。

哺乳動(dòng)物神經(jīng)肽的釋放，在神經(jīng)垂體里面得到了非常徹底的研究。在那里，軸突發(fā)源于下丘腦大細(xì)胞分泌神經(jīng)元，即室旁核（PVH）和視上核的神經(jīng)元，它們的軸突匯聚起來(lái)，在神經(jīng)垂體釋放加壓素（VP）和催產(chǎn)素（OT），進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。VP在調(diào)節(jié)水的穩(wěn)態(tài)方面起關(guān)鍵作用，對(duì)于水分子在腎臟里的重吸起重要作用；而OT的作用是在母體授乳時(shí)誘發(fā)乳汁的釋放［9］。

神經(jīng)垂體提供了神經(jīng)肽釋放研究的良好模型，因?yàn)樯窠?jīng)垂體含有高密度的軸突末梢，末梢內(nèi)充滿了大致密軸心神經(jīng)分泌小泡，直徑180～200 nm。這種標(biāo)本提供相對(duì)大量的、可以檢測(cè)到的肽釋放。神經(jīng)垂體的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)顯示，每個(gè)鋒電位到來(lái)時(shí)肽就釋放，當(dāng)鋒電位頻率增高時(shí)其釋放量會(huì)增高達(dá)一定水平。如果鋒電位爆發(fā)后隨之以一段時(shí)間的沉默，這種模式對(duì)于增強(qiáng)OT或VP的釋放特別有效。有報(bào)道指出，當(dāng)鋒電位爆發(fā)時(shí)，軸突末梢胞質(zhì)的鈣增高，這可能是增強(qiáng)DCV胞外排之關(guān)鍵［9］。

雖然神經(jīng)垂體提供了有用的模型來(lái)研究神經(jīng)肽釋放，但是粗的神經(jīng)垂體神經(jīng)末梢的釋放，與另一種更常見(jiàn)的細(xì)軸突末梢的釋放，兩者之間存在重要的差別：前者的末梢充滿了大的神經(jīng)分泌顆粒，后者可能含有中等大小的（100 nm）含神經(jīng)肽的DCV。大的DCV估計(jì)含有60000～85000個(gè)分子的OT或VP，而多數(shù)神經(jīng)元的中等大小DCV，其體積約為大DCV的1/8，提示它的肽含量相應(yīng)較少（圖6-11）。多數(shù)釋放神經(jīng)肽的軸突含有少數(shù)幾個(gè)DCV，而且其定位并不優(yōu)先靠近突觸前特異化，這點(diǎn)與含有谷氨酸和GABA的清亮小泡是不同的，后者聚集在突觸特異化的活動(dòng)帶附近（圖6-11、圖6-12）。小清亮小泡充灌氨基酸遞質(zhì)的方式是通過(guò)膜的小泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而且就在局部軸突的終扣上進(jìn)行；但是神經(jīng)肽不同，它在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入DCV，而DCV是在細(xì)胞體的高爾基器上產(chǎn)生的。所以，DCV一定要經(jīng)過(guò)軸突內(nèi)運(yùn)輸，運(yùn)送到釋放位點(diǎn)，而此位點(diǎn)離開(kāi)細(xì)胞體有一定的距離。在多數(shù)神經(jīng)元的軸突末梢里面僅有相對(duì)少量的DCV，此事實(shí)提示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)終扣的神經(jīng)肽釋放，若與神經(jīng)垂體的釋放相比，其受空間、時(shí)間的約束程度是不同的，中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)終扣的少量DCV實(shí)現(xiàn)胞裂外排以后，至少要經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)才能得到重新補(bǔ)充［9］。

圖6-11　兩根軸突與大細(xì)胞分泌神經(jīng)元形成對(duì)稱性突觸接觸

突觸前軸突含有少數(shù)幾個(gè)致密軸心小泡（DCV，短箭頭），還有幾個(gè)突觸小清亮小泡（SV）。在突觸后神經(jīng)元上有大致密軸心小泡（Large DCV，LDCV；用長(zhǎng)箭頭表示）。圖寬4 μm。（圖引自［9］）

圖6-12　快速氨基酸突觸傳遞（左）與慢的神經(jīng)肽傳遞（右）之比較（彩圖見(jiàn)圖版此處）圖引自［9］。

無(wú)脊椎動(dòng)物神經(jīng)元被證明對(duì)于研究小泡的運(yùn)輸和釋放是有用的。最近有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物神經(jīng)元的成像研究結(jié)果提示，含有神經(jīng)肽DCV的運(yùn)輸，看起來(lái)是以一種效力很低的方式進(jìn)行的。在細(xì)胞體和遠(yuǎn)端軸突終末之間，這種DCV一會(huì)兒往前走，一會(huì)兒又回去。它們?cè)谖⒐苌涎刂斑M(jìn)的方向行走，所用的運(yùn)動(dòng)蛋白是驅(qū)動(dòng)蛋白-3，然后轉(zhuǎn)換到動(dòng)力蛋白，沿逆向回到軸突始段，在那里變過(guò)方向再向外走。每運(yùn)輸一批DCV，僅少數(shù)幾個(gè)DCV可以走到突觸終扣，因此運(yùn)輸效率很低。在哺乳動(dòng)物的離體三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中，刺激神經(jīng)元可以減少DCV向前傳導(dǎo)的速度，并增加它的停頓時(shí)間。由pH熒光素測(cè)定發(fā)現(xiàn)，DCV膜的融合與釋放在整個(gè)軸突的全長(zhǎng)、在軸突的生長(zhǎng)錐都可以發(fā)生［9］。

當(dāng)看到含肽免疫反應(yīng)性的軸突顯然接觸到另外一個(gè)細(xì)胞時(shí)，經(jīng)常發(fā)生的問(wèn)題是：此軸突是否與它的伴侶形成突觸？從理論上講，這種安排增加了釋放肽的潛在有效性；但此現(xiàn)象也可能是無(wú)關(guān)的，因?yàn)榻?jīng)常看到，肽是在非突觸部位釋放的，而且一般要彌散數(shù)微米來(lái)激活鄰近的細(xì)胞［9］。

為什么研究肽的釋放比較困難？因?yàn)槲覀儸F(xiàn)在關(guān)于快速遞質(zhì)釋放所知道的，都來(lái)自遞質(zhì)釋放的電生理學(xué)反應(yīng)。不論谷氨酸還是GABA都可以在突觸后特異點(diǎn)產(chǎn)生毫秒級(jí)別的非?？焖俚姆磻?yīng)，可以容易地檢測(cè)到突觸后神經(jīng)元上電位或電流的偏移，即EPSP和IPSP。與快速作用的氨基酸遞質(zhì)不同，中樞神經(jīng)系統(tǒng)單個(gè)終扣釋放的神經(jīng)肽的量可能很少，而且更重要的是，接受神經(jīng)肽的細(xì)胞反應(yīng)相對(duì)比較慢，其時(shí)間為幾秒到幾分鐘，難以與低肽的釋放反應(yīng)關(guān)聯(lián)起來(lái)，不像前面測(cè)定EPSP和IPSP那樣只有幾毫秒。因此對(duì)肽來(lái)講，難以做到對(duì)單個(gè)或多個(gè)胞外排事件進(jìn)行量子分析。此外，谷氨酸和GABA所介導(dǎo)的突觸事件，其上升時(shí)間是相對(duì)快速的，個(gè)別的事件可以被分離開(kāi)來(lái)。而與此成對(duì)比，神經(jīng)肽濃度的上升時(shí)間相當(dāng)慢。最后，單個(gè)鋒電位可以釋放GABA或谷氨酸，但是神經(jīng)肽的釋放可能需要高水平的神經(jīng)活性，這就使得研究刺激-反應(yīng)關(guān)系有某些進(jìn)一步的困難。在神經(jīng)垂體內(nèi)游離的大細(xì)胞分泌神經(jīng)元末梢中，在分離的大細(xì)胞分泌神經(jīng)元胞體上，電容測(cè)量記錄方法都被證明對(duì)研究大致密軸心小泡（LDCV）的融合和小清亮小泡的融合有用（圖6-12）［9］。

采用基因工程方法，肽可以被熒光報(bào)告物標(biāo)記，在顯微鏡下觀察，但需要有適當(dāng)?shù)膶?duì)照用來(lái)保證這個(gè)報(bào)告物并不改變肽的運(yùn)輸和釋放。對(duì)于快速遞質(zhì)釋放曾經(jīng)用親脂性染料進(jìn)行了研究，例如FM1-43，這種方法檢測(cè)小泡融合時(shí)染料的內(nèi)化。還有幾種有趣的基因編碼物質(zhì)如pH熒光素，它是一種具有pH敏感性的GFP蛋白變種。熒光素方法對(duì)于研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)終扣的肽釋放，應(yīng)用仍然有限［9］。

研究哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)比較看好的方法是應(yīng)用無(wú)脊椎動(dòng)物神經(jīng)肽——FMRF酰胺。此肽有一個(gè)特點(diǎn)，能直接打開(kāi)離子通道導(dǎo)致鈉內(nèi)流，而不需要G蛋白的耦合。可以把FMRF酰胺和它的受體表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后來(lái)研究釋放肽的快速反應(yīng)。這種方法曾被用來(lái)研究?jī)?nèi)分泌細(xì)胞如何釋放神經(jīng)肽，如胰島β細(xì)胞及腎上腺嗜鉻細(xì)胞。在嗜鉻細(xì)胞上，神經(jīng)肽和兒茶酚胺共同釋放，且來(lái)自單個(gè)小泡［9］。

神經(jīng)肽釋放研究中的另一個(gè)問(wèn)題是，神經(jīng)肽是組成型釋放，即一直在釋放，還是激活以后受調(diào)節(jié)釋放。組成型釋放可導(dǎo)致受體脫敏，反應(yīng)降低，或者可以導(dǎo)致受體慢性激活。對(duì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的研究發(fā)現(xiàn)，BDNF有快釋放和慢釋放兩種形式，可以有不同的反應(yīng)。BDNF的急性激活是作用于酪氨酸受體激酶（tyrosine receptor kinase B，TRKB），導(dǎo)致發(fā)育中海馬神經(jīng)元的神經(jīng)突起伸長(zhǎng)；持續(xù)激活則可能觸發(fā)神經(jīng)突起的分叉。這兩種類型的釋放也可以區(qū)別性地調(diào)節(jié)兩種不同蛋白質(zhì)的表達(dá)——Homer1和Arc［9］。

神經(jīng)肽可以在神經(jīng)元的胞體-樹(shù)突復(fù)合體處進(jìn)行局部釋放。在進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析時(shí)，膜的融合釋放圖像上有無(wú)Ω樣剖像（profile）是一個(gè)有用的指標(biāo)。在固定的哺乳動(dòng)物視上核組織里，經(jīng)過(guò)高鉀或鈣離子通透蛋白A23187刺激后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，神經(jīng)肽胞外排的證據(jù)偶然可以在突觸前及突觸周圍膜上看到。然而更常見(jiàn)的是，與突觸特異化無(wú)關(guān)，胞外排可以在胞體-樹(shù)突、軸突終扣及軸突干等處發(fā)現(xiàn)。下丘腦視上核神經(jīng)分泌細(xì)胞提供了一個(gè)模式系統(tǒng)，可以用來(lái)研究樹(shù)突釋放（圖6-13）。此模式支持高濃度、高水平的神經(jīng)肽合成。大細(xì)胞分泌神經(jīng)元樹(shù)突存在著大量含肽的LDCV。對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行解釋的關(guān)鍵是，大細(xì)胞分泌神經(jīng)元的局部軸突末梢上沒(méi)有DCV。大細(xì)胞分泌神經(jīng)元的軸突投射主要是到神經(jīng)垂體，這是非突觸性末梢。室旁核（PVN）而不是視上核，它的小細(xì)胞分泌神經(jīng)元也合成OT與VP，從這些小細(xì)胞分泌神經(jīng)元發(fā)出的軸突并不靶向到神經(jīng)垂體。相反，它們與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元發(fā)生突觸接觸，可以投射到腦的其他部位和投射到脊髓［9］。

圖6-13　顯示下丘腦視上核催產(chǎn)素神經(jīng)元的顯微切片圖

圖的寬度為900 μm。（圖引自［9］）

一般而言，增加動(dòng)作電位頻率就能夠增加神經(jīng)肽從軸突及樹(shù)突的釋放。鈣離子對(duì)于氨基酸遞質(zhì)的快速釋放是必要的，對(duì)于肽也是如此；但是肽釋放需要更高的胞質(zhì)鈣濃度，也很可能需要更高的神經(jīng)元活性。當(dāng)氨基酸遞質(zhì)分泌的時(shí)候，膜電位去極化激活電壓門控鈣通道，導(dǎo)致鈣通過(guò)質(zhì)膜內(nèi)流，發(fā)動(dòng)突觸小泡的釋放。有幾方面的證據(jù)提示，有一種很巧妙的可能性就是，在某些條件下，樹(shù)突釋放可以不依賴于軸突釋放的形式，其部分原因是，釋放上的差別與軸突和樹(shù)突存在不同的通道有關(guān)。例如，強(qiáng)啡肽從海馬樹(shù)突和軸突釋放，依賴于不同的鈣通道。樹(shù)突的強(qiáng)啡肽釋放是通過(guò)激活L型鈣通道，但軸突釋放與此無(wú)關(guān)。去極化介導(dǎo)的視上核神經(jīng)元樹(shù)突的催產(chǎn)素（OT）釋放，主要依賴于N型鈣通道，較少依賴于P/Q型鈣通道，其他類型的鈣通道在成熟的OT神經(jīng)元中不起什么作用。與此相平行，鈣通道不依賴的機(jī)制在軸突和胞體中也有所不同。在OT細(xì)胞胞體的鈣調(diào)節(jié)肽釋放中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起一定作用，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在軸突末梢的OT釋放中似乎不起重要作用。在另一些系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了軸突末梢和胞體的區(qū)別，例如鈣減少的機(jī)制可以有所不同，包括線粒體、質(zhì)膜鈣泵以及鈉/鈣交換蛋白。最后，大細(xì)胞分泌神經(jīng)元共同釋放的ATP，在軸突末梢和細(xì)胞體上產(chǎn)生不同的反饋效應(yīng)，可以差別性地調(diào)節(jié)肽的釋放，部分由于軸突和細(xì)胞體上有不同的ATP受體存在［9］。

鈣也可以從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入胞質(zhì)。OT或藥物毒胡蘿卜素可引起鈣從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)庫(kù)進(jìn)入胞質(zhì)，直接誘發(fā)樹(shù)突的OT或VP釋放，而不依賴于動(dòng)作電位。細(xì)胞內(nèi)的鈣釋放也可以預(yù)處理此釋放系統(tǒng)，為隨之而來(lái)由電活動(dòng)所引起的釋放做準(zhǔn)備。OT受體的激活誘導(dǎo)了磷脂酶C，結(jié)果產(chǎn)生三磷酸肌醇（inositol trisphosphate，IP3），以后又引起鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放。這種預(yù)處理增強(qiáng)了以后的OT釋放，其原理可能是靠肌動(dòng)蛋白依賴的、含肽小顆粒的運(yùn)動(dòng)，使之朝向質(zhì)膜。OT負(fù)荷DCV的預(yù)處理，部分地是通過(guò)DCV的運(yùn)動(dòng)，使DCV到達(dá)比較接近質(zhì)膜的位置。這對(duì)以后電刺激的到來(lái)，也在一定程度上起到了OT釋放的放大作用。有意思的是，用毒胡蘿卜素預(yù)處理，可以增加鉀介導(dǎo)去極化誘導(dǎo)的OT釋放，其時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)90 min。除了腦細(xì)胞，對(duì)其他細(xì)胞的預(yù)處理DCV的釋放也有研究，特別是合成黃體生成素的垂體細(xì)胞。視前區(qū)神經(jīng)元軸突支配正中隆起，釋放GnRH進(jìn)入門脈血液循環(huán)，此GnRH可以對(duì)垂體細(xì)胞分泌黃體生成素起到預(yù)處理作用。這種細(xì)胞分泌有多個(gè)機(jī)制，顯示了對(duì)此后的GnRH刺激有更強(qiáng)的釋放［9］。

參與樹(shù)突和軸突末梢胞外排的蛋白質(zhì)表達(dá)的差別，也可以解釋釋放的差別。神經(jīng)垂體的大細(xì)胞分泌神經(jīng)元軸突末梢有3個(gè)蛋白質(zhì)——VAMP-2、SNAP-25和突觸融合蛋白-1。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這三者靠近含有OT和VP的DCV。與此不同，雖然同樣是含有突觸融合蛋白-1細(xì)胞類型的樹(shù)突，但VAMP-2、SNAP-25和突觸結(jié)合蛋白-1與OT和VP并不共定位。神經(jīng)肽的合成一般在胞體發(fā)生，但有人報(bào)告，在樹(shù)突也有合成。樹(shù)突合成的神經(jīng)調(diào)質(zhì)BDNF，被認(rèn)為在皮層樹(shù)突棘的發(fā)育中起關(guān)鍵性作用，而且在下丘腦神經(jīng)元上對(duì)瘦素起反應(yīng)，當(dāng)調(diào)節(jié)能量的內(nèi)穩(wěn)態(tài)時(shí)起作用［9］。

樹(shù)突釋放的神經(jīng)肽起什么作用？最有可能的是，神經(jīng)肽作為一個(gè)信號(hào)作用于鄰近神經(jīng)元，使之增加或減少活性。在嗅球處，多數(shù)神經(jīng)元都具有樹(shù)突，包括僧帽神經(jīng)元、絲球周圍神經(jīng)元、顆粒細(xì)胞等。在突觸前特異化部位，樹(shù)突釋放GABA或谷氨酸，許多突觸前樹(shù)突組構(gòu)成為交互作用模式。例如，僧帽細(xì)胞的樹(shù)突釋放谷氨酸，它激活顆粒細(xì)胞樹(shù)突的突觸前成分，顆粒細(xì)胞的突觸前成分又釋放GABA作用于僧帽細(xì)胞，形成反饋抑制。與此不同，腦內(nèi)多數(shù)樹(shù)突并不對(duì)其他細(xì)胞的突觸前成分起作用，樹(shù)突釋放肽似乎并不依賴于突觸特異化。以非突觸性方式釋放的OT或VP的可能作用是募集或抑制鄰近的細(xì)胞，或者使細(xì)胞間的活動(dòng)同步化。OT神經(jīng)元上有OT受體的表達(dá)，VP細(xì)胞上面有加壓素受體（VP受體：vasopressin receptor，VPR）的表達(dá)。在泌乳的時(shí)候，OT釋放以一種協(xié)調(diào)的爆發(fā)性形式發(fā)生。在此情況下，在短暫時(shí)間大約1 s內(nèi)，多個(gè)OT神經(jīng)元快速放電。這種間斷性的、爆發(fā)性的OT釋放，可以防止乳腺上OT受體的去敏感化。如果OT的濃度水平保持在持續(xù)高水平上，受體會(huì)去敏感化；而現(xiàn)在OT的分泌是爆發(fā)性的，所以避免了去敏感化。OT的爆發(fā)性釋放有可能依賴于樹(shù)突釋放OT，樹(shù)突釋放預(yù)處理了鄰近細(xì)胞，使得以后有大量的OT可以從軸突釋放。那是依賴于鋒電位增多的，如前所述［9］。

樹(shù)突釋放肽可以發(fā)動(dòng)逆向信號(hào)到胞體，從而調(diào)制以后局部軸突氨基酸類遞質(zhì)的快速釋放。大細(xì)胞分泌神經(jīng)元胞體和樹(shù)突所釋放的OT，可以減少突觸前谷氨酸和GABA的釋放。開(kāi)始時(shí)人們認(rèn)為，這種情況是由突觸前肽受體介導(dǎo)的?，F(xiàn)在看來(lái)，有可能是釋放的OT激活了OT細(xì)胞上的OT受體，導(dǎo)致內(nèi)源性花生四烯酸釋放增加，花生四烯酸以逆向彌散方式激活突觸前軸突的大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1R；也稱CB1受體），從而減少快速遞質(zhì)的釋放。此逆向作用是由CB1受體介導(dǎo)的。為了達(dá)到突觸前抑制，當(dāng)OT神經(jīng)元去極化以后，OT的釋放似乎是必需的。短暫阻斷突觸活性，可以把OT細(xì)胞從周圍游離出來(lái)，可能是由于放大了局部的細(xì)胞相互作用。在這里，調(diào)制性的肽激活了內(nèi)源性大麻素的分泌，樹(shù)突的釋放抑制了鄰近的突觸前軸突。一個(gè)關(guān)鍵性的特征是內(nèi)源性大麻素的調(diào)制；在許多腦區(qū)里的情況是，內(nèi)源性大麻素從突觸后神經(jīng)元釋放并逆向彌散，調(diào)制突觸前軸突的快速遞質(zhì)。例如GABA或谷氨酸的釋放，時(shí)間可以是短的或是長(zhǎng)而持久的，其機(jī)制是降低突觸前的鈣而增加突觸前的鉀電導(dǎo)，或者直接抑制小泡融合。在VP神經(jīng)元中，去極化誘導(dǎo)的內(nèi)源性大麻素釋放通過(guò)鈣依賴的機(jī)制也減弱了突觸前的GABA活性。此外，誘發(fā)的VP釋放減少了IPSC頻率，這是由于另一個(gè)內(nèi)源性大麻素不依賴的機(jī)制［9］。

視前區(qū)/隔區(qū)神經(jīng)元合成GnRH，這些神經(jīng)元的樹(shù)突能釋放肽，通過(guò)它協(xié)調(diào)其他鄰近GnRH神經(jīng)元的活動(dòng)。對(duì)靈長(zhǎng)類胚胎GnRH神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)神經(jīng)元活動(dòng)增加時(shí)，胞體-樹(shù)突的FM1-43標(biāo)記增加，這提示FM1-43與GnRH免疫反應(yīng)性是共定位的。今后，若能用成像方法進(jìn)一步證實(shí)成熟活體GnRH神經(jīng)元的胞體-樹(shù)突釋放，將能更進(jìn)一步支持以上看法［9］。