雙脫氧終止法和化學(xué)降解法自1977年提出并逐漸完善，是目前公認(rèn)的兩種最通用、最有效的DNA序列快速分析方法，Sanger、Maxam和Gilbert等人也因此分享了1979年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

但是，這兩種測(cè)序技術(shù)在實(shí)際操作中都存在一些共同的問(wèn)題，如存在放射性核素的污染，且同位素的散射與衰變影響測(cè)序結(jié)果讀取的準(zhǔn)確性，測(cè)序操作步驟繁瑣，不能滿足大規(guī)模測(cè)序的需求。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、精密儀器分析制造技術(shù)和分子生物學(xué)研究的迅速發(fā)展，DNA自動(dòng)化測(cè)序儀取得了突破性進(jìn)展，已成為今天DNA序列分析的主流。

測(cè)序儀在發(fā)展中的一項(xiàng)重大改進(jìn)就是用熒光標(biāo)記染料代替了放射性同位素，并將聚丙烯酰胺凝膠電泳的自動(dòng)化操作取代傳統(tǒng)的手工操作，特別是利用計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)對(duì)測(cè)序結(jié)果的收集和分析。對(duì)DNA測(cè)序儀的另一項(xiàng)重大改進(jìn)出現(xiàn)在20世紀(jì)90年代中期，并在90年代末實(shí)現(xiàn)了DNA測(cè)序儀商品化，這就是用集束化的毛細(xì)管電泳代替了凝膠電泳。集束毛細(xì)管電泳的工作方式極大地提高了DNA測(cè)序的自動(dòng)化程度，而且通過(guò)提高電泳電壓，顯著地加快了分析速度，使DNA測(cè)序工作成為一種可規(guī)模化進(jìn)行的生產(chǎn)線。

自動(dòng)DNA測(cè)序系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理是采用熒光標(biāo)記DNA片段，并用激光激活的熒光探測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)序列反應(yīng)的分離產(chǎn)物，讀出電泳條帶所示的堿基順序。雖然各種DNA自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)采用不同的檢測(cè)方法，但Sanger法所采用的雙脫氧鏈末端終止法的原理，亦是現(xiàn)今自動(dòng)化測(cè)序的最佳選擇方案。即大都采用Sanger的雙脫氧核苷酸鏈終止法原理進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，主要的差別在于非放射性標(biāo)記物和反應(yīng)產(chǎn)物(標(biāo)記DNA片段)分析系統(tǒng)。

德國(guó)海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)等提出和設(shè)計(jì)的ALF全自動(dòng)激光熒光DNA測(cè)序系統(tǒng)采用非放射性的單一Cy5熒光素標(biāo)記測(cè)序引物。采用Sanger法進(jìn)行反應(yīng)，分別生成4組終止于不同種類(lèi)堿基、末端帶有Cy5熒光素標(biāo)記的DNA片段。A、G、C和T4組反應(yīng)物在相鄰的4個(gè)泳道被分離，每個(gè)泳道均有由激光器和探測(cè)器組成的探測(cè)裝置對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，采集到的熒光信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理，獲得目標(biāo)DNA的最終序列，這種自動(dòng)化測(cè)序方法簡(jiǎn)稱(chēng)為“一色四泳道”。

然而，目前被各大測(cè)序公司和科研院校廣泛使用的ABI型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀則采用另一種熒光標(biāo)記方法。其特點(diǎn)是采用4種熒光染料分別標(biāo)記終止物ddNTP或引物，經(jīng)Sanger測(cè)序反應(yīng)后，反應(yīng)產(chǎn)物3′端(標(biāo)記終止物法)或5′端(標(biāo)記引物法)帶有不同的熒光標(biāo)記。這樣，一個(gè)目標(biāo)DNA樣品的4個(gè)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物可以在同一泳道內(nèi)進(jìn)行電泳分離，從而降低測(cè)序泳道間遷移率差異對(duì)精確性的影響。通過(guò)毛細(xì)管電泳將各個(gè)熒光標(biāo)記片段分開(kāi)，熒光檢測(cè)器同步掃描，并在CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)上同步成像，采集代表不同堿基信息的不同顏色的熒光信號(hào)。通過(guò)計(jì)算機(jī)的處理，結(jié)果能以電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種方式輸出，這種自動(dòng)化測(cè)序方法簡(jiǎn)稱(chēng)為“四色一泳道”，如圖6-4。

目前，該類(lèi)自動(dòng)化測(cè)序系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大規(guī)模的基因組測(cè)序和大量待測(cè)樣品的序列分析。此外，亦可以使用各種輔助軟件進(jìn)行DNA定量分析和大小分析，故可廣泛應(yīng)用于基因突變分析(SSCP)、DNA指紋圖譜分析、基因連鎖圖譜分析及基因表達(dá)水平分析等。

圖6-4　“四色一泳道”熒光標(biāo)記自動(dòng)化測(cè)序基本原理