2010年10月，在美國和全世界范圍內(nèi)進行的脂肪組織衍生干細胞臨床試驗就有32項，這些都是由國家和私營機構(gòu)支持的并且登記在冊的。近3年來這些研究的數(shù)量迅速增加。除了現(xiàn)有臨床試驗的靶標疾病外，脂肪組織衍生干細胞的臨床治療潛力更加廣泛，可以治療的疾病譜也更寬。在這些疾病中，肌肉萎縮疾病正受到人們的密切關(guān)注。我們將在這里評估源自脂肪組織的干細胞治療肌肉疾病的潛能。

（一）肌萎縮和間充質(zhì)干細胞

骨骼肌即使在遭受嚴重的外傷時也具有強大的再生能力。大多數(shù)再生肌纖維起源于衛(wèi)星細胞，即肌前體細胞，它們位于肌纖維中、基底層下，平時處于靜止狀態(tài)，一旦遭受外傷即能進行自我修復(fù)。在損傷區(qū)域產(chǎn)生的不同信號作用下，它們增殖分化成肌母細胞，或者與現(xiàn)存的纖維匯合，或者互相融合成新的多核纖維。同時這些衛(wèi)星細胞再重新進入壁龕，使后者保持源頭豐富。在肌萎縮中替換壞死的纖維時也出現(xiàn)了類似的過程，Duchenne肌萎縮或者杜興肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）就是這樣一個例子。這是一種嚴重而多發(fā)的疾病，源于先天性或者遺傳性肌營養(yǎng)不良蛋白基因的突變/缺乏，導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏所致。這一致死性的肌肉退行性疾病是一種最常見的遺傳性肌萎縮疾病，平均3500個男孩中就有1例發(fā)病。肌營養(yǎng)不良蛋白是一種肌膜下蛋白質(zhì)，通過大蛋白復(fù)合物來連接肌膜和細胞外間質(zhì)。在很多次壞死再生周期之后，衛(wèi)星細胞的修復(fù)能力被消耗殆盡。肌纖維萎縮并被纖維組織和脂肪組織所替代。隨后功能喪失導(dǎo)致嚴重的病理狀態(tài)。雖然杜興肌營養(yǎng)不良在20年前就已有報道，但到目前人們還沒有發(fā)現(xiàn)阻止其變性的治療措施。大家正在努力尋找包括以藥物、基因和細胞為基礎(chǔ)的各種治療措施。應(yīng)用同源或者異源細胞的主要目的是誘導(dǎo)受損肌細胞的再生修復(fù)或者重新組成。這樣，尋找一種能夠有效再生肌肉的細胞群落在評估新的細胞治療療效上就顯得意義非凡。包括肌母細胞、中胚層成血管細胞、肌肉或者血液中CD133+細胞在內(nèi)的幾種細胞類型都成為人們關(guān)注的重點。間充質(zhì)干細胞因其具有分化潛能以及強大的自我更新能力也成為很有潛力的候選細胞。

在1995年以前，間充質(zhì)干細胞被認為是一種多潛能前體細胞，但尚未有其成肌特性的報道。其后，Arnold Caplan實驗室報道了大鼠的骨髓源間充質(zhì)干細胞經(jīng)脫甲氧-5氮雜胞苷復(fù)合物處理后可以分化成多核肌管，表明這些細胞可能成為肌前體細胞。他們猜想在特定條件下間充質(zhì)干細胞能夠被誘導(dǎo)成為成肌表型。這種情況也可能在再生肌肉中找到。他們把鼠骨髓源間充質(zhì)干細胞注射到mdx鼠肌肉內(nèi)。mdx鼠是一種杜興肌營養(yǎng)不良動物模型，因為它們的肌肉主要由經(jīng)歷退化和再生周期的肌營養(yǎng)不良蛋白陰性肌纖維構(gòu)成，但這種鼠并不出現(xiàn)嚴重的病理狀態(tài)。它們是研究肌肉再生的最好模型。移植之后，肌營養(yǎng)不良蛋白陽性肌細胞數(shù)量明顯增加，表明間充質(zhì)干細胞能夠分化成肌細胞。這些研究結(jié)果擴大了間充質(zhì)干細胞的分化潛能，同時也提出了重要的新問題，包括這些細胞成肌能力的生理學(xué)相關(guān)性問題。對于間充質(zhì)干細胞肌肉修復(fù)能力的研究為人們開辟了一個嶄新的領(lǐng)域。

（二）脂肪源干細胞具有形成在體肌的潛力

正如在其他研究領(lǐng)域的發(fā)展一樣，繼應(yīng)用骨髓來源間充質(zhì)干細胞的開拓性工作之后，來自于脂肪組織的間充質(zhì)干細胞也被認為有肌肉分化能力。在21世紀的早期，就有人已經(jīng)開始研究脂肪源干細胞的成肌潛力。

曾經(jīng)有研究報道將脂肪源干細胞移植到動物的肌肉內(nèi)。Bacou和同事們率先研究了脂肪血管基質(zhì)碎片細胞，即未分化脂肪細胞群的潛能。研究者將收集到的自體細胞采用LacZ標記后移植到損傷的兔肌肉內(nèi)，發(fā)現(xiàn)它們可以發(fā)展到再生肌肉纖維的10%。細胞移植2個月之后，肌肉變得發(fā)達而且肌力增加。該研究小組因此證實脂肪組織基質(zhì)血管碎片具有肌形成潛能。同樣地，將未經(jīng)培養(yǎng)的鼠脂肪組織衍生干細胞注射到mdx鼠的肌肉中或者因股動脈切除損傷的非癱瘓的小鼠肌肉中，通過去除大腿動脈產(chǎn)生非動力性肌萎縮，發(fā)現(xiàn)受體肌肉各增加了10%和20%。但是將體外擴充的脂肪組織衍生干細胞注射進受體鼠體內(nèi)后只發(fā)現(xiàn)少量的鼠肌纖維來源于注射的供體細胞。最后還發(fā)現(xiàn)，由人的脂肪組織衍生干細胞形成的肌纖維已經(jīng)長入再生鼠肌纖維中。脂肪組織衍生干細胞有助于受傷的免疫缺陷鼠和mdx鼠的肌纖維再生（圖12-2）。通過人特異性抗體標記鼠的肌纖維切片，檢測到脂肪組織衍生干細胞細胞源性肌纖維。從注射了脂肪組織衍生干細胞的鼠肌纖維中，通過提取RNA進行RT-PCR檢測時發(fā)現(xiàn)了更多的人特異性肌纖維標志物。將吸脂術(shù)得到的脂肪組織衍生干細胞移植到鼠下肢肌萎縮2B模型也可以獲得類似的結(jié)果。因此，移植到肌肉再生條件下的脂肪組織衍生干細胞顯示出可分化成骨骼肌纖維的巨大潛能。

圖12-2　hMADS細胞在肌肉再生中的作用。野生小鼠、mdx和經(jīng)hMADS注射的mdx小鼠的脛骨前肌冷凍橫斷切片染色顯示肌營養(yǎng)不良蛋白的表達。大約500000個hMADS細胞被注射入mdx小鼠的肌肉內(nèi)，前者針對肌營養(yǎng)不良蛋白的遺傳缺失進行連續(xù)的降解和再生循環(huán)。hMADS移植2周后，可見肌營養(yǎng)不良蛋白部分的恢復(fù)

（三）脂肪源干細胞的體外成肌潛力

為了進一步研究脂肪源性干細胞的體外成肌潛力，人們在細胞培養(yǎng)皿上進行了大量的研究。

（四）自身成肌潛力

當前，幾個團隊都在研究脂肪組織衍生干細胞自體成肌分化的機制，研究者之間的共識是在沒有任何肌肉樣環(huán)境的條件下，培養(yǎng)的脂肪組織衍生干細胞成肌分化能力非常有限。只有在當細胞接近融合時撤除血清和添加胰島素等適宜培養(yǎng)條件下，肌母細胞的完全分化能力才會出現(xiàn)。然后肌母細胞停止增殖并表達成肌決定因子（myogenic determination factors，MyoD，Myf5）及其他成肌調(diào)控因子（myogenic regulatory factors，myogenin，MRF4）。它們?nèi)诤铣杉氶L的多核肌管，表達眾多的肌肉終末標志物。肌管是可以在細胞培養(yǎng)中所能得到的最終端分化物，只有在存在神經(jīng)支配的活體，肌管才能完全形成肌纖維。在研究脂肪組織衍生干細胞在成肌分化的所有報道中，都可發(fā)現(xiàn)這些干細胞應(yīng)用肌形成培養(yǎng)基培養(yǎng)時，在早期能表達早期甚至一些晚期肌肉標志物，但難以分化成為肌管。這些結(jié)論已經(jīng)從吸脂獲得的脂肪組織衍生干細胞和切取的脂肪組織實驗中得到驗證。即使我們使用最佳的培養(yǎng)基，脂肪組織衍生干細胞中肌小管的出現(xiàn)率仍然很低，不到0.1%，并且只在少數(shù)供體細胞中才有出現(xiàn)。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在從鼠的皮下脂肪組織和脂肪墊獲得的脂肪組織衍生干細胞中。因此，脂肪組織衍生干細胞的肌分化能力低于脂肪分化潛能和軟骨分化潛能。這就出現(xiàn)了一個問題：決定活體肌肉再生能力的是所有脂肪組織衍生干細胞細胞群共有的低肌肉分化水平潛能呢，還是只限于少量細胞亞群所具有的成肌潛能呢？

（五）脂肪組織衍生干細胞和成肌細胞共培養(yǎng)時的成肌潛能

脂肪組織衍生干細胞具有極弱的自發(fā)性成肌潛能，但是它們在活體促進肌纖維再生的能力，說明肌肉環(huán)境對成肌分化的重要性。為了研究這一問題，人們將脂肪組織衍生干細胞在體外與成肌細胞或者使用成肌細胞或者肌小管的條件培養(yǎng)基共同培養(yǎng)。將人或者鼠的脂肪組織衍生干細胞使用GFP標記后和C2C12鼠成肌細胞株或者原代培養(yǎng)的鼠成肌細胞混合，在成肌分化培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)。兩種方法培養(yǎng)都可以檢測到GFP陽性肌小管，而且人的GFP陽性肌小管表達巢蛋白，后者在肌細胞中強烈表達。這表明脂肪組織衍生干細胞能夠融合于肌細胞而合成肌小管。另外，Di Rocco及其同行發(fā)現(xiàn)分化中的成肌細胞含有促進脂肪組織衍生干細胞分化的可溶性因子。該實驗表明，共同培養(yǎng)時脂肪組織衍生干細胞和肌細胞一樣能夠融合成肌小管，并能夠表達肌蛋白。然而，這些肌蛋白的產(chǎn)量很低，最多時只有1%的脂肪組織衍生干細胞能夠產(chǎn)生肌小管。而且，很難證實和肌細胞共同培養(yǎng)能明顯增加脂肪組織衍生干細胞的細胞單獨成肌分化潛能。但是在低水平百分比時也需要考慮到測量的精確程度，所以不能完全排除少量脂肪組織衍生干細胞可能在不易察覺的情況下與肌細胞進行融合的情況。和肌細胞緊密接觸的一些非成肌細胞，也可能參與分化中肌細胞大量融合的進程。

（六）脂肪組織衍生干細胞的基因修飾

以上數(shù)據(jù)表明，在達到可以進行臨床應(yīng)用的標準之前，人們還需對脂肪組織衍生干細胞的肌肉修復(fù)潛能有所改進。為達到這一目的，可以考慮如下兩種方案。假設(shè)并不是所有基質(zhì)血管碎片細胞均具有成肌潛能，則可以通過例如細胞克隆，從脂肪基質(zhì)血管碎片細胞中獲取更多的具有成肌潛能的細胞亞群。這個假設(shè)目前為止還沒有得到證實。另外，如果候選的細胞比率很少，特別是在這些細胞不能進行體外擴增時，就會存在一定的困難。解決方案是獲取大量的脂肪組織，但這卻只能在某些特定條件下才能達到。另一個替代方案是對脂肪組織衍生干細胞進行基因修飾，使它們具有更高的成肌潛能。我們使用脂肪組織衍生干細胞，假定細胞對一種關(guān)鍵的成肌基因（例如成肌決定因子）的過度表達，可能明顯增強它們的內(nèi)源性成肌潛能。表達成肌決定因子基因的脂肪組織衍生干細胞可以通過在磷酸肌酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）啟動子的控制下，編碼鼠的成肌決定因子基因，然后攜帶成肌決定因子基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞而獲得。這些細胞經(jīng)過復(fù)雜的基因修飾后成為成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞。

（七）成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞的體外成肌分化潛能

成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞在肌形成條件培養(yǎng)基中形成多核肌管，與真正的肌母細胞一樣，表達早期和晚期分化成肌標志物。而野生的或者磷酸肌酸激酶-LacZ病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的LacZ-脂肪組織衍生干細胞并不表達此標志物，后者可作為陰性對照（圖12-3）。

圖12-3　hMADS細胞的體外成肌分化，表現(xiàn)為對MyoD的表達。與野生型的hMADS細胞不同，在成肌培養(yǎng)條件下，MyoD-hMADS細胞可以與肌管完美融合。肌肉蛋白肌間線蛋白、巢蛋白、肌漿球蛋白和肌營養(yǎng)不良蛋白染色后標記為紅色，細胞核經(jīng)Hoechst 34580復(fù)染以檢測多細胞核肌管，呈現(xiàn)藍色。標尺=20μm

在共同培養(yǎng)試驗中，大量脂肪組織衍生干細胞和杜興肌營養(yǎng)不良肌母細胞融合構(gòu)成杜興肌營養(yǎng)不良-脂肪組織衍生干細胞雜合肌管，可以持續(xù)表達肌萎縮蛋白，后者是一種杜興肌營養(yǎng)不良缺陷蛋白。與肌母細胞的融合能力是肌細胞的基本特性，因此成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞需要這種能力。肌萎縮蛋白的出現(xiàn)表明成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞基因組在融合肌管中表達，因此杜興肌營養(yǎng)不良肌母細胞和改良的脂肪組織衍生干細胞的細胞融合并不干擾成肌分化過程。這是未來臨床應(yīng)用的先決條件，因為肌肉修復(fù)時需要和宿主肌母細胞進行融合。多潛能細胞的一個重大風險就是它們可能分化成為不受歡迎的細胞系。而且，很多肌萎縮患者在肌肉間隙有纖維脂肪組織浸潤，這些脂肪細胞分泌大量的細胞因子形成一個成脂環(huán)境，因此研究肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞的成脂分化潛能就很有必要。只要在細胞融合具備成脂分化的條件時，野生型或者LacZ-脂肪組織衍生干細胞就很容易進行成脂分化。脂肪組織衍生干細胞的高度成脂分化潛能明顯地受到肌決定因子強制性表達的抑制。總結(jié)以上結(jié)果表明肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞具有顯著的體外成肌潛能，對于這一潛能的進一步研究可以用于肌萎縮的修復(fù)。

（八）成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞的體內(nèi)肌肉修復(fù)能力

人們將肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞移植到Rag2－/－gC－/－免疫缺陷鼠的再生肌肉內(nèi)，用以評估脂肪組織衍生干細胞中肌決定因子的表達在肌肉修復(fù)中的重要性。對照組為來自野生型或者LacZ-脂肪組織衍生干細胞。肌肉再生由在動物后肢的脛骨前肌制造冷傷常規(guī)誘導(dǎo)產(chǎn)生。4周后應(yīng)用人特異性lamin A/C抗體可以檢測到脂肪組織源性細胞核。這些陽性的細胞核不僅出現(xiàn)在肌纖維之內(nèi)，也可見成簇狀或者變成衛(wèi)星細胞散在地存在于肌纖維之間，表明了脂肪組織衍生干細胞在鼠肌纖維的不同部位都有存活（圖12-4）。相對野生型或者LacZ-脂肪組織衍生干細胞而言，成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞源細胞核更多地出現(xiàn)在肌纖維內(nèi)。肌肉斷層切片表明，人和鼠的細胞核總是出現(xiàn)在同一肌纖維內(nèi)。這表明肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞和鼠的再生纖維融合，這和體外的研究結(jié)果一致。

應(yīng)用人特異性肌肉標志物研究成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞源性肌纖維時發(fā)現(xiàn)，人血影蛋白一般表達在肌纖維的肌膜上，在lamin A/C細胞核陽性染色的再生區(qū)域肌纖維細胞膜上都可檢測到（圖12-5）。脂肪組織衍生干細胞源性肌纖維的存在也可以通過其他肌肉標志物或者通過RT-PCR特異性擴增驗證得以證實（圖12-6）。上述這些標志物包括肌纖維膜上的δ肌膜蛋白聚糖和肌纖維細胞膜上的肌萎縮蛋白。人血影蛋白標記程度可作為測定成肌決定因子修飾的脂肪組織衍生干細胞所產(chǎn)生活體效應(yīng)的定量檢測指標。與野生型或者LacZ-脂肪組織衍生干細胞相比，成肌決定因子-脂肪組織衍生干細胞對人血影蛋白陽性纖維的表達數(shù)量要高5倍（圖12-7）。更重要的是，在整個實驗過程沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤或者其他副作用的發(fā)生。

圖12-4　小鼠肌肉中由hMADS衍生的細胞核。500000個hMADS細胞被注射入Rag2-/-免疫缺陷小鼠的脛骨前肌肌肉內(nèi)。注射同時對肌肉行冷傷處理以刺激肌肉再生。1個月后，提取肌肉制作橫斷切片進行人特異性抗lamin A/C（紅色）和抗laminin（綠色）染色。細胞核由DAPI（藍色）復(fù)染。在所有的肌肉中都發(fā)現(xiàn)了由hMADS衍生的細胞核

總之，脂肪組織衍生干細胞中成肌決定因子的被動表達增強了所移植細胞促進肌肉再生的能力，從而有益于肌肉損傷的修復(fù)。另外，它們還阻止了脂肪組織衍生干細胞的內(nèi)在成脂潛能。評判該技術(shù)手段的有效性還需要和目前治療動物肌萎縮模型的最有效細胞進行比較，即血管源性成血管母細胞和外周血中的AC133＋細胞。