Real-time PCR以PCR反應(yīng)體系中的熒光染料為指示劑,從而實現(xiàn)了目的基因擴增與數(shù)據(jù)收集、分析同時進行并實時監(jiān)測。理論上,在PCR擴增指數(shù)增長期,同一熒光強度下, PCR擴增的循環(huán)數(shù)(Cq值)與初始模板量呈對數(shù)呈線性關(guān)系,從而能夠?qū)崿F(xiàn)對初始模板量的定量分析,這一方法已廣泛用于基因表達差異、基因拷貝數(shù)改變等的定量分析。

能夠?qū)崿F(xiàn)real-time PCR實時檢測的化學(xué)發(fā)光方法主要有兩類:探針法和染料法。依據(jù)發(fā)光原理,探針主要分為兩類:水解型探針(hydrolysis probe)和雜交型探針(hybridization probe)。水解型探針(如Taqman探針)兩端分別標(biāo)記熒光基團(5′端)和淬滅基團(3′端),探針完整時,熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收,沒有熒光產(chǎn)生。PCR擴增時,探針與模板特異性結(jié)合,DNA聚合酶的5′-3′外切酶活性將探針?biāo)?熒光基團切掉,遠(yuǎn)離淬滅基團,因此熒光能夠產(chǎn)生。雜交型探針一般由2條探針組成,一條5′端標(biāo)記供體基團,3′端封閉(阻止繼續(xù)延伸),另一條3′端標(biāo)記受體基團。自然狀態(tài)下,只能檢測到供體基團發(fā)出的熒光,當(dāng)2條探針都與目的基因片段特異性結(jié)合時,供體基團與受體基團相互靠近,通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移,供體基團激發(fā)受體基團發(fā)出熒光,此時能夠檢測到受體基團發(fā)出的熒光。染料法是應(yīng)用與雙鏈DNA結(jié)合的染料(如SYBR Green,Eva Green),在DNA擴增時與雙鏈DNA非特異性結(jié)合,從而收集熒光信號。

根據(jù)已知基因突變位點設(shè)計特異探針,衍生出了以real-time PCR為基礎(chǔ)的基因分型技術(shù),代表性的有Taqman探針法和ARMS法。用飽和DNA雙鏈熒光染料(如LCGreen)代替定量分析常用的不飽和熒光染料,又衍生出能夠?qū)崿F(xiàn)對未知突變掃描的高分辨熔解曲線(High resolution melting)分析法等技術(shù)。它們都是目前應(yīng)用較廣的基因突變檢測技術(shù)。

(一)Taqman探針法

Taqman探針法是通過特定基因型探針與相應(yīng)靶基因完全互補結(jié)合,以熒光指示區(qū)分不同基因型,檢測已知基因突變的方法。

1.基本原理 依據(jù)要檢測的已知基因突變位點設(shè)計相應(yīng)的一對探針,一條與突變型基因互補,一條與野生型基因互補。兩條探針5′端分別標(biāo)記不同的熒光基團。在PCR擴增過程中,退火時探針同與其互補的模板DNA結(jié)合,延伸時,由DNA聚合酶(具有5′-3′外切酶活性)將探針?biāo)?釋放熒光,real-time PCR儀收集熒光信號。檢測結(jié)束時,依據(jù)兩種熒光信號(分別由兩條探針標(biāo)記的)的比例,判斷樣品DNA的基因型。

2.基本操作步驟

(1)設(shè)計含有待檢測基因突變位點的引物和Taqman探針(通常PCR產(chǎn)物長度小于400bp,Taqman探針15~30bp,2條探針分別標(biāo)記不同熒光基團,常用Fam和Hex。近年來推出的3′端標(biāo)記非熒光淬滅分子Taqman-MGB探針能夠有效降低本底熒光信號強度)。

(2)PCR擴增,熒光信號收集(選用具有5′-3′外切酶活性的Taq酶)。

(3)數(shù)據(jù)分析,結(jié)果判斷(與突變型互補的探針熒光信號為主,提示樣品DNA為純和突變型;與野生型互補的熒光信號為主,提示樣品為野生型;兩種熒光信號都有,提示樣品為雜合突變型。)

3.儀器選擇 具有探針標(biāo)記熒光素激發(fā)光與發(fā)射光波長通道的real-time PCR儀均可以用于本方法檢測。

(二)ARMS法

ARMS(amplification refractory mutation system)法,即擴增阻滯突變系統(tǒng)技術(shù),又稱等位基因特異性擴增法(allele-specific amplification,ASA),是通過特異性引物選擇性擴增特定基因型的基因片段,并用電泳或real-time PCR法判定相應(yīng)基因型,從而檢測特定已知基因突變有無的方法。

1.基本原理 針對含有待檢測突變位點設(shè)計兩對引物擴增同一段目的基因,其中下游引物相同,上游引物有兩條(突變位點位于上游引物3′端),一條與野生型基因完全互補,另一條與突變型完全互補。PCR擴增時,只能擴增與引物完全互補基因型的基因片段。在突變型引物加入熒光標(biāo)記(如蝎形探針),如果待檢測樣品含有相應(yīng)基因突變,就能檢測到熒光信號,如樣品沒有突變,則檢測不到熒光信號。

2.基本操作步驟

(1)特異性引物設(shè)計:特異性引物包括2條分別與突變型、野生型基因完全互補的上游引物和1條共同的下游引物。突變型引物與野生型引物僅有1個堿基(突變位點)的差異,對于野生型基因,突變型引物會引起3′端的錯配而抑制PCR延伸反應(yīng)。然而,有的錯配(如GG錯配)較弱,野生型目的基因也可能以突變型引物擴增出來。因此設(shè)計引物時常要在突變鄰近位點增加1個錯配堿基,防止野生型目的基因的錯誤延伸,從而增加檢測特異性。

(2)PCR擴增:在PCR擴增時應(yīng)注意不斷優(yōu)化、調(diào)整實驗條件,如篩選Taq酶濃度,為減少非特異性擴增加入甲酰胺等。

(3)電泳或real-time PCR法檢測基因型:由于real-time PCR法檢測基因型時,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不需要取出避免了二次污染的可能,PCR反應(yīng)與檢測的同時進行又提高了檢測效率,縮短實驗時間,故目前應(yīng)用的較電泳法更為廣泛。

3.儀器選擇 real-time PCR儀檢測通道與熒光標(biāo)記激發(fā)光與發(fā)射光波長匹配的均可用于本檢測方法。

(三)高分辨熔解曲線(High resolution melting)分析法

高分辨熔解曲線分析法以飽和DNA雙鏈熒光染料為指示劑記錄升溫過程中目的基因片段熔解的曲線,通過比較待測樣品與野生型基因(陰性對照)的熔解曲線差異,對目的基因片段中突變有無進行掃描,以達到檢測未知突變的目的。

1.基本原理 隨著溫度的升高DNA雙鏈會逐漸解鏈(熔解),與雙鏈嵌合的飽和熒光染料分子隨之解離,熒光強度減弱。隨溫度增加熒光強度下降的曲線稱為DNA熔解曲線,它能代表目的基因片段雙鏈解開的全過程。目的基因片段中的任何單一堿基變化都會影響溶解過程,進而改變?nèi)劢馇€形狀。因此,可以通過與野生型基因片段熔解曲線形狀比對,判斷目的基因片段中是否存在突變。

2.基本操作步驟

(1)引物設(shè)計:一般使用的是普通PCR引物,不需要特殊標(biāo)記和修飾,縮短目的基因片段長度可以提高突變檢測的靈敏度,通常目的基因片段小于200bp較好。

(2)PCR擴增(擴增體系中含有飽和熒光染料)。應(yīng)注意優(yōu)化PCR反應(yīng)條件和避免非特異性產(chǎn)物擴增。這是是能否準(zhǔn)確判斷檢測結(jié)果的關(guān)鍵。

(3)熔解曲線信號收集、結(jié)果分析。比對樣品與野生型基因樣品的溶解曲線形狀,如有差異則可判定擴增樣品DNA片段中存在突變。雜合性突變,熔解曲線形狀改變較大,容易與野生基因型區(qū)分;純和性突變,熔解曲線形狀變化較小,主要表現(xiàn)為熔解曲線在溫度軸(橫軸)上的平移,應(yīng)該特別注意。

3.儀器選擇 檢測需要使用配有高分辨熔解曲線通道的real-time PCR儀或高分辨熔解曲線分析儀(如LightScanner?96等)。