第四節(jié)　細(xì)胞免疫標(biāo)記檢驗(yàn)

細(xì)胞分子生物學(xué)的發(fā)展，為血液病的診斷提供了最有價(jià)值性的診斷依據(jù)，由于細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)所攜帶或表達(dá)一系列特異性抗原，應(yīng)用單克隆抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記測定，提高了白血病診斷的科學(xué)性、準(zhǔn)確性與客觀性。

一、生物素-親和素酶標(biāo)法

【原理】親和素酶標(biāo)法（ABC）是依據(jù)親和素和生物素二者間有很強(qiáng)的親和力，生物素可以和抗體相結(jié)合，且結(jié)合后仍保持與親和素連接的能力。辣根過氧化物酶標(biāo)記在親和素與生物素復(fù)合物上形成生物素-親和素-過氧化物酶復(fù)合物即ABC，細(xì)胞抗原成分與特異性抗體第1結(jié)合后，與已標(biāo)記上生物素的第2抗體反應(yīng)，再與ABC結(jié)合。ABC上辣根過氧化物酶作用于顯色劑，使其產(chǎn)生有色沉淀，指示抗原的存在。

【結(jié)果】（同APAAP法）

二、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶僑聯(lián)酶標(biāo)法

【原理】堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶僑聯(lián)酶標(biāo)（APAAP）法，是用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物標(biāo)記已知抗體或抗抗體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。先用鼠單抗制備一種堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶單克隆抗體（APAAP）復(fù)合物，然后按照細(xì)胞抗原成分與第1抗體（鼠抗人單抗）、第2抗體（兔抗鼠抗體）、APAAP復(fù)合物依次結(jié)合后，通過堿性磷酸酶水解外來底物顯色，達(dá)到定位。

【結(jié)果】高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，其中細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)有紅色標(biāo)志物著色的細(xì)胞為陽性，無紅色標(biāo)志物著色的細(xì)胞為陰性。計(jì)算出陽性率。

三、流式細(xì)胞儀檢測法

【原理】流式細(xì)胞儀是將標(biāo)本用熒光素標(biāo)記的懸液標(biāo)記細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀的毛細(xì)管，分辨細(xì)胞形態(tài)、大小及熒光特征。流式細(xì)胞儀利用計(jì)算機(jī)記錄處理，快速對(duì)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行參數(shù)定量分析的方法。

【結(jié)果】流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示以直方圖形式表示。

1.單參數(shù)直方圖　它是一維數(shù)據(jù)用得最多的圖形，可用來進(jìn)行定性分析和定量分析。在圖中橫坐標(biāo)表示熒光信號(hào)或散射光強(qiáng)度的相對(duì)值，其單位為“道數(shù)”?？v坐標(biāo)通常表示細(xì)胞出現(xiàn)的頻率或相對(duì)細(xì)胞數(shù)。

2.二維點(diǎn)陣圖　為了顯示兩個(gè)獨(dú)立數(shù)與細(xì)胞定量的關(guān)系，可采用二維點(diǎn)陣圖的方式。例如在點(diǎn)陣圖的橫坐標(biāo)是CD8淋巴細(xì)胞的相對(duì)含量，縱坐標(biāo)是CD4細(xì)胞的相對(duì)含量。圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，每個(gè)帶你與縱軸的距離即表示該點(diǎn)的相對(duì)值CD4值。可以由點(diǎn)陣圖得到兩個(gè)直方圖，但兩個(gè)直方圖無法反演成一個(gè)二維點(diǎn)陣圖。

【臨床意義】

抗人白細(xì)胞抗原CD系列單克隆抗體與流式細(xì)胞儀和多色熒光染料的聯(lián)合應(yīng)用，成為研究造血細(xì)胞免疫表型，分化發(fā)育、激活增殖、生物學(xué)功能和惡性變關(guān)系及造血細(xì)胞分離純化強(qiáng)有力的手段，促進(jìn)了血液學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展。

1.對(duì)造血干、祖細(xì)胞的研究/或CD34⁺造血干細(xì)胞（HSC）/祖細(xì)胞（HPC）分析與鑒定，由于CD34⁺ HSC/ HPC具有自我更新、多向分化以及重建長期造血細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)與功能，分離純化造血干/祖細(xì)胞具有重要理論與應(yīng)用價(jià)值，也是研究造血增殖、分化、調(diào)節(jié)機(jī)制、干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增、干細(xì)胞庫的建立、造血干細(xì)胞移植凈化以及基因治療等的條件和手段。人類CD34⁺細(xì)胞已成為能識(shí)別人類最早造血干/祖細(xì)胞的重要標(biāo)志。人類CD34⁺細(xì)胞分別占骨髓、臍血和外周血有核細(xì)胞的1%～4%，0.5%～1.5%和0.05%～0.1%。

2.T淋巴細(xì)胞亞群檢測　-用CD4和CD8單抗可將外周淋巴器官和血液中的T細(xì)胞分為CD3+CD4+CD8-（Th）和CD3+CD4-CD8+（Ts）兩個(gè)主要亞群。同時(shí)也可測定NK細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞亞群等。臨床上常測定T淋巴細(xì)胞亞群，計(jì)算CD3+CD4-CD8- 、CD3+CD4+CD8-（Th）和CD3+CD4-CD8+（Ts）的量，并計(jì)算CD3+CD4+CD8-（Th）/CD3+CD4-CD8+（Ts）比值作為免疫狀態(tài)，在某些疾病的診斷、病情分析、監(jiān)測治療和判斷預(yù)后的參數(shù)。同時(shí)又是移植排斥反應(yīng)的參考指標(biāo)。

3.急性白血病分型診斷　白血病是白血病細(xì)胞分化到某個(gè)階段受到阻滯后呈克隆性異常增殖的結(jié)果。它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病其發(fā)病機(jī)制不同，白血病細(xì)胞具有與其對(duì)應(yīng)的正常細(xì)胞相同的分化抗原，利用白血病細(xì)胞表面的抗原標(biāo)記進(jìn)行免疫分型。該法結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)可明顯提高對(duì)血液細(xì)胞的識(shí)別能力，對(duì)白血病分型診斷準(zhǔn)確率由傳統(tǒng)的60%～70%提高到97%。

4.惡性淋巴瘤分類　淋巴瘤的正確分類有助于提高診斷治療效果和預(yù)后的客觀判斷。免疫表型、組織病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)的結(jié)合，使淋巴瘤的分類與診斷更為合理準(zhǔn)確，能反映其生物特性。

（1）通過淋巴細(xì)胞表型進(jìn)行連續(xù)評(píng)價(jià)，可弄清淋巴細(xì)胞分化過程中各階段細(xì)胞抗原表達(dá)的情況。一個(gè)單一表型淋巴細(xì)胞群體的檢出，表明某一淋巴細(xì)胞亞群的單克隆性增生，這是惡性淋巴瘤的特征。

（2）利用單克隆抗體和細(xì)胞免疫標(biāo)記技術(shù)不僅可以確定淋巴瘤細(xì)胞的來源（B細(xì)胞、T細(xì)胞、組織細(xì)胞或樹突細(xì)胞），而且可對(duì)細(xì)胞在組織中的分布情況進(jìn)行精確觀察。如B細(xì)胞淋巴細(xì)胞瘤單一細(xì)胞群體的標(biāo)志，是具有某一種類型的輕鏈或重鏈或某種特定B細(xì)胞抗原的表達(dá)。

5.白血病微量殘留的檢測　通過檢測白血病細(xì)胞特異性抗原來研究微量殘留，觀察有無特異性抗原標(biāo)志細(xì)胞的比率的大小，還有某些特殊標(biāo)志物如TdT正常只表達(dá)于T細(xì)胞上，存在于胸腺和骨髓有限的細(xì)胞中，大部分白血病細(xì)胞表達(dá)TdT，因此如果在外周血和腦脊液里發(fā)現(xiàn)TdT陽性細(xì)胞，可定為惡性細(xì)胞。應(yīng)用多種標(biāo)志組合的方式，包括CD34、CD56、TdT，淋巴抗原，結(jié)合其抗原密度，可以靈敏的檢測大部分白血病的微量殘留。

6.對(duì)血小板的研究　血小板膜糖蛋白是血小板參與止血與血栓形成等多種病理生理反應(yīng)的基礎(chǔ)。應(yīng)用抗血小板膜糖蛋白抗體作為分子探針對(duì)血小板進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記檢測，對(duì)臨床上診斷先天性、獲得性血小板膜糖蛋白異常所致的疾病診斷、治療、預(yù)防，尤其是針對(duì)血栓性疾病的診斷、預(yù)防由重要的理論與實(shí)踐依據(jù)。如CD62P、CD63是活化血小板最為特異靈敏度分子標(biāo)志物。血小板無力癥其CD41、CD61明顯缺乏。巨大血小板綜合征有CD42b、CD42ad的缺乏。

7.骨髓移植及免疫重建的鑒定　可通過標(biāo)記的CD34當(dāng)克隆抗體檢測外周血中的干細(xì)胞并定量。對(duì)移植前骨髓細(xì)胞免疫表型分析，可了解骨髓處理狀況，如T細(xì)胞的剔除，化學(xué)凈化和用免疫磁珠對(duì)特殊細(xì)胞進(jìn)行剔除的結(jié)果，并能確定病人進(jìn)行移植的類型。還可研究各種細(xì)胞因子在移植前的變化與并發(fā)癥的因果關(guān)系。并可檢測活化淋巴細(xì)胞來診斷移植排斥反應(yīng)，若發(fā)現(xiàn)CD8⁺HLA-DR⁺細(xì)胞增加，表示可能產(chǎn)生排斥現(xiàn)象。