第五節(jié)　造血細(xì)胞培養(yǎng)檢驗

一、造血祖細(xì)胞培養(yǎng)檢驗

【原理】血液、骨髓液或臍血經(jīng)過分離獲得單個核細(xì)胞在適當(dāng)?shù)腍GF或 HGFs作用下，在體外半固體瓊脂上形成由不同成熟階段的粒細(xì)胞和單核細(xì)胞組成的細(xì)胞集落。參與CFU-GM生長的集落刺激因子如：GM-CSF、IL-3、G-CSF、M-CSF及SCF等。每個集落可視為有一個粒、單核細(xì)胞系造血祖細(xì)胞增殖、分化而來。集落數(shù)的多少可以反應(yīng)一定有核細(xì)胞數(shù)量條件下粒-單細(xì)胞水平。

【結(jié)果判斷】培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下觀察。半固體瓊脂上大于40個細(xì)胞團(tuán)稱為集落，小于40個細(xì)胞團(tuán)稱為簇，一般3～5個細(xì)胞為小簇。

【參考值】

各個實驗室的CFU-GM產(chǎn)率隨條件不同有差異。BM參考值為（150±60）個/2×10⁵有核細(xì)胞，細(xì)胞簇與集落之比為5～20：1；

外周血：集落數(shù)為BM的1/10；臍血：（48±6）個/2×10⁵有核細(xì)胞。

【臨床意義】

1.CFU-GM減少　常見于再生障礙性貧血、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿、急性白血病、紅血病、骨髓纖維化及骨髓增生異常綜合征。

2.CFU-GM增加　慢性粒細(xì)胞性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥（部分患者伴白細(xì)胞增多）及缺鐵性貧血部分患者。

3.CFU-GM逐漸恢復(fù)在參考范圍內(nèi)　再生障礙性貧血、急性白血病緩解期及慢性粒細(xì)胞性白血病緩解期。

4.CFU-GM生長特性與白血病關(guān)系?、貱FU-GM在急性粒細(xì)胞性白血病中有四種生長類型：不生長型、小細(xì)胞簇型、大細(xì)胞簇型及集落型，大細(xì)胞簇型和不生長型的緩解率低。②CFU-GM在急性白血病時，細(xì)胞簇與集落之比增高，這種表現(xiàn)主要與急性白血病細(xì)胞釋放白血病抑制物有關(guān)。

5.CFU-GM與MDS的關(guān)系　若CFU-GM的集落數(shù)降低，而細(xì)胞簇與集落之比正常者，轉(zhuǎn)變?yōu)榘籽〉目赡苄越档?0%，若生長型和小細(xì)胞簇型者，約為15%轉(zhuǎn)化為白血?。蝗艏?xì)胞簇與集落之比值增高以及細(xì)胞培養(yǎng)為大細(xì)胞簇型或無生長型者，大多數(shù)病例變成急性白血病。

二、紅系祖細(xì)胞的培養(yǎng)

【原理】在培養(yǎng)體系中選擇甲基纖維素做支架物，加入適量的EPO 和BPA，使骨髓中的造血細(xì)胞形成BFU-E和CFU-E。每個集落可視為一個紅系祖細(xì)胞增殖分化而來，所以集落生長多少可反映所培養(yǎng)的造血細(xì)胞中紅系祖細(xì)胞的量。BFU-E和CFU-E對EPO和BPA的敏感性及集落細(xì)胞多少的不同，培養(yǎng)方法也有差別。

【結(jié)果判斷】CFU-E集落8～50個細(xì)胞組成的團(tuán)，BFU-E集落50個以上細(xì)胞組成的團(tuán)，形似煙火禮花，故稱BFU-E。紅系集落在倒置顯微鏡下的特點與粒系集落不同，與CFU-GM相比，紅系集落背景稍暗、集落內(nèi)細(xì)胞圓整，體積較小，因為細(xì)胞漿內(nèi)有血紅蛋白的合成，集落呈暗黃色，晚幼紅細(xì)胞為主組成的集落表現(xiàn)更為明顯，也可用過氧化物染色技術(shù)來鑒定Hb的存在。

【參考值】

骨髓：BFU-E集落：（25±8）個/2×10⁵有核細(xì)胞。

CFU- E集落：（140±68）個/2×10⁵有核細(xì)胞。

外周血：BFU-E集落：（26±4）個/2×10⁵有核細(xì)胞。

BFU-E集落：（76±7）個/2×10⁵有核細(xì)胞。

【臨床意義】

1.BFU-E和BFU-E減少　見于再生障礙性貧血、單純紅細(xì)胞性再障、急性白血病、慢粒急變、紅白血病及鐵粒幼細(xì)胞性貧血。

2.CFU-ECFU-E增加　見于真性紅細(xì)胞增多癥、原發(fā)性骨髓纖維化及部分慢?；颊摺?/p>

3. BFU-E和BFU-E逐漸恢復(fù)正常與白血病、MDS有關(guān)。

三、巨核系祖細(xì)胞培養(yǎng)

【原理】以血漿凝塊或甲基纖維素為支架物，加入再生障礙性貧血患者的血清或TPO、IL-3及SCF等生長因子，使骨髓中巨核細(xì)胞系祖細(xì)胞形成CFU-MK。人CFU-MK培養(yǎng)仍不穩(wěn)定，較多的因素影響CFU-MK的產(chǎn)率。

【結(jié)果判斷】培養(yǎng)10～14天后，用倒置顯微鏡觀察，含有3個巨核細(xì)胞以上者為CFU-MK集落，還有20～200個巨核細(xì)胞集落者稱BFU-MK。CFU-MK可作為形態(tài)學(xué)及免疫化學(xué)鑒定。以血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa（CD41/ CD61）陽性為CFU-MK的標(biāo)準(zhǔn)。

【參考值】骨髓：（16.4±10.3）個/2×10⁵有核細(xì)胞。

【臨床意義】

1.CFU-MK減少　常見于再生障礙性貧血、獲得性無巨核細(xì)胞性血小板減少性紫癜、骨髓增生性疾病、血小板減少癥和白血病。

2.CFU-MK增加　常見于慢性粒細(xì)胞性白血病、在慢粒急變時有較高的CFU-MK。

四、混合祖細(xì)胞培養(yǎng)

【原理】以甲基纖維素為支架物，配以各種造血因子（IL-3、GM-CSF 和EPO）PHA-LCM加EPO作為CFU-MIX刺激因子，體外受檢者骨髓造血細(xì)胞可形成含有粒、紅、單核及巨核細(xì)胞系的混合集落（CFU-GEMM）。

【結(jié)果判斷】培養(yǎng)14天，用倒置顯微鏡觀察鑒別集落，每個集落至少有50個細(xì)胞，大多為粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，巨核細(xì)胞和有核紅細(xì)胞數(shù)量不定。難以從形態(tài)學(xué)鑒定的CFU-GEMM，可用染色法、細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光染色等技術(shù)來鑒定。

【參考值】國內(nèi)報道，（10.8±4.9）個/2×10⁵有核細(xì)胞，在CFU-GEMM中，單純粒、紅混合集落為34.5%，含巨噬細(xì)胞者為56.3%。

【臨床意義】

1.CFU-GEMM有助于調(diào)節(jié)多向祖細(xì)胞分化與增值的各種刺激因子的生物活性的定量研究。

2.CFU-GEMM產(chǎn)率低，臨床疾病研究還較少，在生障礙性貧血CFU-GEMM減少，慢性粒細(xì)胞白血病其增值率高。

總之，造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)或克隆分析概括有以下幾個作用；

1.研究造血細(xì)胞的分化成熟及調(diào)節(jié)機(jī)制。

2.各種細(xì)胞因子對造血的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

3.造血細(xì)胞與非造血細(xì)胞之間相互作用及調(diào)控的分子機(jī)制。

4.藥物對骨髓造血的影響。

5.藥物的篩選及生產(chǎn)。

6.造血系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制、診斷和療效分析。