第二章　粒細(xì)胞檢驗(yàn)的方法

一、中性粒細(xì)胞功能檢查

（一）全血粒細(xì)胞天然免疫功能測(cè)定

原理　待測(cè)新鮮枸櫞酸抗凝血，其血漿含有補(bǔ)體成分，將此血漿加入癌細(xì)胞懸液中，經(jīng)孵育后癌細(xì)胞可旁路激活補(bǔ)體，黏附補(bǔ)體C分子，再加入自身粒細(xì)胞，帶有C3b等補(bǔ)體分子的癌細(xì)胞可被數(shù)量眾多的粒細(xì)胞補(bǔ)體受體黏附結(jié)合形成花環(huán)狀，花環(huán)率的高低可作為粒細(xì)胞在血循環(huán)中天然免疫力高低變化的指標(biāo)之一。

參考值　計(jì)數(shù)一個(gè)癌細(xì)胞黏附3個(gè)或3個(gè)以上粒細(xì)胞為一朵花環(huán)，計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，算出花環(huán)率。

臨床應(yīng)用

血循環(huán)中粒細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，有多種天然免疫功能。該試驗(yàn)可作為粒細(xì)胞天然免疫功能變化的客觀指標(biāo)之一，結(jié)合流式細(xì)胞儀測(cè)定粒細(xì)胞CD35、CR3、紅細(xì)胞CD35、CD44、CD58、CD59、CD55等指標(biāo)，可用于探討與紅細(xì)胞天然免疫功能之間的關(guān)系，在基礎(chǔ)理論、臨床應(yīng)用、中醫(yī)藥免疫學(xué)以及腫瘤免疫學(xué)研究中都具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

（二）墨汁吞噬試驗(yàn)

原理　血液中中性粒細(xì)胞（單核細(xì)胞）對(duì)細(xì)菌、異物等具有吞噬作用。在100μl的肝素抗凝血中，加入10μl的墨汁，在37C孵育4小時(shí)，涂片染色鏡下觀察中性粒細(xì)胞對(duì)墨汁的吞噬情況，并計(jì)算吞噬率及吞噬指數(shù)。

參考值　成熟中性粒細(xì)胞吞噬率44%～104%，吞噬指數(shù)6～246。

臨床應(yīng)用

中性粒細(xì)胞僅成熟階段才具有吞噬功能，單核細(xì)胞幼稚型和成熟型都具有吞噬能力。急性單核細(xì)胞白血病 M5a為弱陽(yáng)性，M5b吞噬指數(shù)明顯增高。急性粒細(xì)胞白血病（M2）、急性早幼粒細(xì)胞白血病（M3）和急性淋巴細(xì)胞白血病的白血病細(xì)胞吞噬試驗(yàn)為陰性。急性粒-單核細(xì)胞白血病呈陽(yáng)性反應(yīng)，慢性粒細(xì)胞白血病的成熟中性粒細(xì)胞吞噬能力明顯減低。該試驗(yàn)對(duì)鑒別白血病類(lèi)型有一定價(jià)值。

（三）白細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)

原理　制備白細(xì)胞懸液，將待測(cè)的中性粒細(xì)胞與葡萄球菌混合，37C溫育一定時(shí)間后，細(xì)菌可被中性粒細(xì)胞吞噬。在鏡下觀察中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的情況，根據(jù)吞噬率和吞噬指數(shù)即可反映中性粒細(xì)胞的吞噬功能。

參考值

① 吞噬率（%）＝吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)/200個(gè)中性粒細(xì)胞×100%

正常為 60.0%～65.8%

② 吞噬指數(shù)=200個(gè)中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的總數(shù)/200個(gè)中性粒細(xì)胞

正常為1.1 ～1.0

臨床應(yīng)用

本試驗(yàn)簡(jiǎn)單可靠，可了解中性粒細(xì)胞的吞噬功能。如細(xì)菌感染時(shí)中性粒細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)增高，對(duì)疑有中性粒細(xì)胞功能異常綜合征或補(bǔ)體所致的調(diào)理缺陷癥者，有幫助確診的價(jià)值。

（四）血清溶菌酶活性試驗(yàn)

原理　溶菌酶能水解革蘭氏陽(yáng)性球菌細(xì)胞壁的乙酰氨基多糖成分，使細(xì)胞破裂。用對(duì)溶菌酶較敏感的微球菌懸液為作用底物，根據(jù)微球菌的溶解程度來(lái)檢測(cè)血清或尿中溶菌酶活性。常用比濁法。

參考值　血清（5～15）mg/L；

　　　　尿（0～2）mg/L

臨床應(yīng)用

本試驗(yàn)對(duì)鑒別急性白血病的類(lèi)型有重要參考價(jià)值。人體血清的溶菌酶，主要來(lái)自血液的單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，其中以單核細(xì)胞含量最多。在中性粒細(xì)胞中，從中幼粒到成熟粒細(xì)胞可隨細(xì)胞的成熟程度而增高。淋巴細(xì)胞中無(wú)此酶。血清和血漿中的溶菌酶大部分是由破碎的白細(xì)胞所釋放。

1.血清溶菌酶含量增高　可見(jiàn)于部分急性髓性白血病。①急性單核細(xì)胞白血病的血清溶菌酶含量明顯增高，尿溶菌酶含量也增高。②急性?！獑魏思?xì)胞白血病血清溶菌酶含量也有明顯增高，其增高程度與白細(xì)胞總數(shù)有關(guān)。在治療前其含量明顯高，表示細(xì)胞分化程度比好，預(yù)后也較好。③急性粒細(xì)胞性白血病的血清溶菌酶含量可正?；蛟龈?，臨床意義與急性粒—單核細(xì)胞白血病相似。急性粒細(xì)胞性白血和急性單核細(xì)胞白血病都是在治療緩解白細(xì)胞減少時(shí)，其含量也同時(shí)下降，在復(fù)發(fā)時(shí)上升。

2.急性淋巴細(xì)胞白血病時(shí)多數(shù)血清溶菌酶含量減低，少數(shù)正常。慢性粒細(xì)胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急變時(shí)下降。

（五）硝基四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)

原理　硝基四氮唑藍(lán)（Nitroblue Tetrazolium，NBT）是一種染料，當(dāng)被吞入中性粒細(xì)胞后，有產(chǎn)生過(guò)氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸在磷酸己糖旁路中NADPH氧化脫下的氫，而被還原為非水溶性的藍(lán)黑色甲月替（formazan）顆粒，呈點(diǎn)狀或片狀沉著在胞漿內(nèi)有酶活性的部位，可在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

參考值　正常成人的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10%以下。若有10%以上中性粒細(xì)胞能還原NBT，即為NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性；低于10%為陰性。

臨床應(yīng)用

一般認(rèn)為，中性粒細(xì)胞在吞噬殺菌過(guò)程中，能量消耗增加，磷酸己糖旁路代謝增強(qiáng)，還原NBT形成甲 月替能力亦因之增強(qiáng)，故此試驗(yàn)可間接研究中性粒細(xì)胞殺菌能力。

1.用于中性粒細(xì)胞吞噬殺菌功能異常的過(guò)篩鑒別和輔助診斷　NBT還原試驗(yàn)陰性見(jiàn)于兒童慢性肉芽腫（chronic granulomatous disease，CGD），葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺乏癥，髓過(guò)氧化物酶缺陷癥、自身氧化物缺陷和Job綜合征（高IgE、A）等。如為可疑CGD時(shí)，可用化學(xué)方法提取四氮唑藍(lán)作光電比色做定量檢查。也可用細(xì)菌內(nèi)毒素激發(fā)試驗(yàn)，即取0.5ml肝素抗凝血和10μg細(xì)菌內(nèi)毒素混合后按上述方法試驗(yàn)，如NBT陽(yáng)性細(xì)胞.＞29%即可否定CGD。另外，可用氧電極或華伯儀（warbury apparatrs）測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬后的耗氧量。正常人耗氧明顯，患者不明顯。亦可用流式細(xì)胞儀通過(guò)超氧陰離子的產(chǎn)生以測(cè)定氧化酶活性來(lái)用于CGD的診斷。

2.用于細(xì)菌感染和病毒感染的鑒別　細(xì)菌感染時(shí)，患者的NBT還原陽(yáng)性細(xì)胞在10%以上，而病毒感染或其他原因發(fā)熱的患者則在10%以下。

3.器官移植　器官移植后發(fā)熱，若非細(xì)菌感染所致，其N(xiāo)BT還原試驗(yàn)陰性；若該試驗(yàn)陽(yáng)性，則提示可能有細(xì)菌感染。

（六）中性粒細(xì)胞殺菌功能測(cè)定

原理　將中性粒細(xì)胞、細(xì)菌（大腸桿菌或葡萄球菌）及調(diào)理素按一定比例混合，定時(shí)取樣培養(yǎng)。計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落以了解殺菌情況。

參考值　殺菌率計(jì)算：

殺菌率（%）=（ 1-作用30、60或90min菌落數(shù)/0 min 菌）×100%

中性粒細(xì)胞對(duì)大腸桿菌殺菌率 ＞90%，對(duì)葡萄球菌殺菌率 ＞85%。

臨床應(yīng)用

是判斷中性粒細(xì)胞殺菌能力的一個(gè)指標(biāo)。

（七）白細(xì)胞趨化試驗(yàn)（濾膜滲入法）

原理　在微孔濾膜的一側(cè)放入粒細(xì)胞，另一側(cè)放入趨化因子（細(xì)菌毒素、補(bǔ)體C3a、C5a等），檢測(cè)離體粒細(xì)胞潛過(guò)濾膜到達(dá)趨化因子這一側(cè)定向移動(dòng)的能力。

參考值　趨化指數(shù)：3.0～3.5

臨床應(yīng)用

粒細(xì)胞有趨化功能，該試驗(yàn)是觀察粒細(xì)胞向感染處運(yùn)動(dòng)能力的一項(xiàng)目重要檢測(cè)方法。趨化功能缺陷見(jiàn)于Lazy白細(xì)胞綜合征、Chediak-Higashi綜合征、代謝性疾?。ㄌ悄虿?、尿毒癥）、高IgE綜合征、感染、白血病及各種皮炎等。當(dāng)趨化因子生成不足或其抑制因子過(guò)多時(shí)也出現(xiàn)趨化功能缺陷。

（八）白細(xì)胞趨化試驗(yàn)（瓊脂糖平板法）

原理　瓊脂糖平板中央孔加入中性粒細(xì)胞，左側(cè)孔加入趨化因子，右側(cè)孔加入對(duì)照液。37C、5%CO₂條件下溫育4～8h后，待孔中液干后染色，用顯微鏡測(cè)量細(xì)胞從中央孔向左側(cè)孔的移動(dòng)距離A和向右側(cè)孔移動(dòng)距離B。

參考值　趨化指數(shù)　A／B

臨床應(yīng)用

同濾膜法。

（九）中性粒細(xì)胞黏附功能

原理　中性粒細(xì)胞有在體外黏附異物的性質(zhì)，用肝素抗凝血通過(guò)尼龍纖維后，計(jì)數(shù)通過(guò)前、后的中性粒細(xì)胞數(shù)

參考值

正常健康人黏附率為 47%～83% 。

臨床應(yīng)用

是判斷中性粒細(xì)胞黏附能力的一個(gè)指標(biāo)。

二、粒細(xì)胞代謝及產(chǎn)物檢驗(yàn)

（一）中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色　見(jiàn)細(xì)胞化學(xué)染色章

（二）過(guò)氧化物酶染色　見(jiàn)細(xì)胞化學(xué)染色章。

（三）特異性酯酶染色　見(jiàn)細(xì)胞化學(xué)染色章。

（四）嗜酸粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白測(cè)定（ECP測(cè)定）

原理　嗜酸粒細(xì)胞顆粒中含有強(qiáng)堿性毒性蛋白，其是細(xì)胞毒的主要來(lái)源。嗜酸粒細(xì)胞活化后釋放的強(qiáng)堿蛋白主要有 ECP、MBP（主堿性蛋白）、EPX（嗜酸粒細(xì)胞蛋白X）、EPD（嗜酸粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶）。ECP被認(rèn)為是嗜酸粒細(xì)胞特異性標(biāo)志，可反映嗜酸粒細(xì)胞的活化程度。

參考值　免疫螢光法：正常兒童血清含量為0～8.94μg/L，哮喘兒童為0.48～36.00μg/L。

臨床應(yīng)用

患者ECP水平與末梢血中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)無(wú)關(guān)。ECP水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ECP水平可隨治療效果變化，尤其在皮質(zhì)激素應(yīng)用后，隨著嗜酸粒細(xì)胞活化降低，ECP水平也明顯降低。測(cè)定ECP對(duì)過(guò)敏性哮喘的診斷、監(jiān)視及抗炎治療等均有重要意義。

（五）嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)

原理　嗜堿性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的顆粒能被堿性染料（Alcian 藍(lán)）染成藍(lán)色，容易辨認(rèn)。當(dāng)嗜堿性粒細(xì)胞與過(guò)敏原混合一定時(shí)間后，過(guò)敏原即與結(jié)合在細(xì)胞上的IgE橋聯(lián)，產(chǎn)生脫顆粒作用使細(xì)胞不再被著色，染色的細(xì)胞數(shù)明顯減少。用患者本身的嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)的稱(chēng)為直接法，用動(dòng)物嗜堿粒細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)的稱(chēng)為間接法。試驗(yàn)中用緩沖液代替過(guò)敏原作對(duì)照。

參考值　加Alcian藍(lán)染液后計(jì)數(shù)9個(gè)大方格內(nèi)染成藍(lán)色的嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)（F），

計(jì)算脫顆粒指數(shù)（DI）：

DI（%）＝F對(duì)照管/（F對(duì)照管－F測(cè)定管）×100%

判斷結(jié)果以DI＞30%為陽(yáng)性。即嗜堿粒細(xì)胞顆粒釋放能力增高。

臨床應(yīng)用

是嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒功能的常做試驗(yàn)。在過(guò)敏性疾病或骨髓增殖疾病時(shí)，嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒陽(yáng)性。

（六）白三烯測(cè)定（LTB4測(cè)定）

原理　白三烯是花生四烯酸代謝產(chǎn)物，最初在白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)故名白三烯leukotrine，LT）。粒細(xì)胞磷脂中的花生四烯酸在脂氧化酶作用下加氧生成白三烯化合物（LTS），其后再經(jīng)水解生成穩(wěn)定的LTB4。

參考值　LTB4（ 45768.02～46559.98）ng／107 中性粒細(xì)胞 。

臨床應(yīng)用

LTS具有很強(qiáng)的生物活性，參與體內(nèi)多種生理生化代謝；并且與臨床某些疾病的病理機(jī)制密切相關(guān)。LT有極強(qiáng)的趨化作用，LTB4為重要的炎癥介質(zhì)，在各種炎癥部位含量均增高，在腦血栓、腦損傷、急性心梗時(shí)白細(xì)胞產(chǎn)生LTB4增加。

（七）中性粒細(xì)胞質(zhì)膜標(biāo)志酶測(cè)定　質(zhì)膜指中性粒細(xì)胞去除胞質(zhì)中顆粒和細(xì)胞核后的完整膜，即為胞質(zhì)體（cytoplast）。質(zhì)膜上的各種受體與標(biāo)志酶與中性粒細(xì)胞的功能相關(guān)。

1.酸性磷酸酶測(cè)定

原理　酸性磷酸酶表達(dá)在中性粒細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)，在初級(jí)顆粒和核膜上也有表達(dá)。在酸性緩沖液中（pH4.8）中，該酶使對(duì)硝基苯磷酸（P-NPP）水解為黃色的對(duì)硝基苯酚和磷，對(duì)硝基苯酚在405nm處有吸收峰，吸光度與酶活性呈正相關(guān)。

酶活性計(jì)算：活性單位用對(duì)硝基苯酚的含量表示。AU＝PNP nmol／（min·mg）Protein

臨床應(yīng)用

多種癌癥（子宮、胃、結(jié)腸和乳腺癌）患者中性粒細(xì)胞酸性磷酸酶活性明顯增高。

2.堿性磷酸酶測(cè)定

原理　堿性磷酸酶表達(dá)在中性粒細(xì)胞質(zhì)膜外側(cè)。在堿性條（pH10）對(duì)硝基苯磷酸被該酶水解生成黃色的對(duì)硝基苯酚和磷，并在405nm處有吸收峰，吸光度與酶活性呈正相關(guān)。

酶活性計(jì)算：活性單位用對(duì)硝基苯酚的含量表示。

AU＝ PNP nmol/min/mg Protein

臨床應(yīng)用

堿性磷酸酶是一種反映中性粒細(xì)胞在循環(huán)中和脾中壽命的標(biāo)志酶。在細(xì)菌感染性疾病時(shí)其活性增高；但慢性粒細(xì)胞性白血病患者中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶缺失或活性低下。

3. 5＇- 核苷酸酶測(cè)定（5＇-NT）

原理　5＇-核苷酸酶不僅是中性粒細(xì)胞的標(biāo)志酶，也是淋巴細(xì)胞成熟的標(biāo)志物。本法用金屬離子Ni抑制5＇-核苷酸酶的活性，從不抑制的樣品中測(cè)出的吸光度（A）值減去Ni抑制的樣品的A值，即可從無(wú)特異性的磷酸酶中得出5＇-核苷酸酶活性。

酶活性計(jì)算　用每分鐘每mg蛋白催化ATP釋放磷（Pi）的nmol數(shù)表示：Pi nmol/mg Pr/min。

臨床應(yīng)用

5＇-核苷酸酶活性隨著粒細(xì)胞的分化成熟而下降，其在原幼粒細(xì)胞膜上表達(dá)較多。

三、粒細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢查

（一）氚標(biāo)記脫氧胸苷測(cè)定

原理　³H-TdR是DNA合成的前期物質(zhì)，可準(zhǔn)確地而穩(wěn)定地標(biāo)記細(xì)胞核。在粒細(xì)胞培養(yǎng)中加入PHA或其他特異性抗原刺激后，使粒細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。再加入3H-TdR，其可被S期的幼稚粒細(xì)胞攝入?yún)⑴c其DNA合成，攝入的量與DNA合成的量及增殖細(xì)胞數(shù)成正比，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定3H-TdR的攝入量，可判斷粒細(xì)胞的增殖水平。

參考值　SI ＜ 2

臨床應(yīng)用

正常時(shí)粒細(xì)胞在骨髓增殖池、血液循環(huán)池及組織邊緣池之間處于動(dòng)態(tài)平衡。外周血中粒細(xì)胞數(shù)約為（2.5～5.5）×10／L。在各種病理情況下，這種平衡受到不同程度的破壞而異常。該試驗(yàn)在對(duì)白血病細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的研究中可證實(shí)白血病細(xì)胞是一群非同步化的增殖細(xì)胞群。

（二）潑尼松刺激試驗(yàn)

原理　正常時(shí)骨髓中性粒細(xì)胞儲(chǔ)備量大于外周血中的粒細(xì)胞總量，潑尼松能刺激骨髓中性粒細(xì)胞由儲(chǔ)備池向外周血釋放。如果受檢者骨髓粒細(xì)胞儲(chǔ)備池正常，服用潑尼松后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后外周血中性粒細(xì)胞的絕對(duì)值明顯增高。反之，則無(wú)此作用或作用不明顯。

參考值　服藥后中性粒細(xì)胞最高絕對(duì)值＞20×10⁹/L（服藥后5h為中性粒細(xì)胞上升到高峰的時(shí)間）。

臨床應(yīng)用

本方法操作方便，結(jié)果可靠，間接但準(zhǔn)確地反映骨髓中粒細(xì)胞的儲(chǔ)備功能。中性粒細(xì)胞減少患者，如服用潑尼松后外周血中性粒細(xì)胞最高絕對(duì)值 ＞ 20×10⁹/L，說(shuō)明患者骨髓中性粒細(xì)胞的儲(chǔ)備池正常，粒細(xì)胞減少非骨髓粒細(xì)胞生成所致而可能是骨髓釋放障礙或其他原因引起。該試驗(yàn)對(duì)于某些骨髓受損引起的輕度粒細(xì)胞減少有一定參考及診斷價(jià)值。反之，則反映儲(chǔ)備不足。

（三）腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)

原理　中性粒細(xì)胞進(jìn)入血流后，約半數(shù)進(jìn)入循環(huán)池；半數(shù)黏附于血管壁構(gòu)成邊緣池，此部分粒細(xì)胞在外周血不被計(jì)數(shù)。注射腎上腺素后血管收縮，黏附于血管壁上的粒細(xì)胞脫落，從邊緣池進(jìn)入循環(huán)池，致外周血粒細(xì)胞數(shù)增高。

參考值　粒細(xì)胞上升值一般低于（1.5～2.0）×10⁹/L

臨床應(yīng)用

本試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，可用于鑒別粒細(xì)胞減少癥是否為“假性”減少。注射腎上腺素后，如外周血白細(xì)胞能較注射前增加1倍以上或粒細(xì)胞上升值一般超過(guò)（1.5～2.0）×10⁹/L，說(shuō)明患者邊緣池粒細(xì)胞增多，屬粒細(xì)胞分布異常，如無(wú)脾大，可考慮“假性”粒細(xì)胞減少。如果增高低于上述值，須進(jìn)一步確定粒細(xì)胞減少原因。

（四）二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記檢測(cè)

原理 利用含有放射性磷的二異丙酯氟磷酸鹽（diisopropyl fluorophosphate，DF ³²P）作為膽堿酯酶的抑制劑，其能與粒細(xì)胞膜上的膽堿酯酶結(jié)合。結(jié)合了DF ³²P的粒細(xì)胞在體內(nèi)破壞后，其結(jié)合的DF P也不再被利用，即不再與其他細(xì)胞結(jié)合。作粒細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測(cè)時(shí)，采血即制成標(biāo)記物，立刻靜脈注射。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間再次采血，分離粒細(xì)胞，通過(guò)追蹤觀察其放射活性的變化，可測(cè)知外周血中有關(guān)粒細(xì)胞的參數(shù)。

參考值

粒細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定：標(biāo)記粒細(xì)胞半衰期（T1/2）：4～10小時(shí)；血中滯留時(shí)間：10～14小時(shí)。

全血粒細(xì)胞池（total blood granulocyte pool，TBGP）：35～70×10⁷/kg

循環(huán)粒細(xì)胞池（circulation granulocyte pool，CGP）：20～30×10⁷/kg

邊緣粒細(xì)胞池（marginal granulocyte pool，MGP）：15～40×10⁷/kg

粒細(xì)胞周轉(zhuǎn)率（granulocyte turnover rate，GTR）：60～160×10⁷/（kg · d）

臨床應(yīng)用

本方法操作比較麻煩，但結(jié)果可靠?？梢栽隗w外及體內(nèi)標(biāo)記粒細(xì)胞以觀察骨髓中細(xì)胞增殖情況。靜脈注射可以測(cè)定骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)間，中性粒細(xì)胞儲(chǔ)備池及骨髓中幼稚粒細(xì)胞轉(zhuǎn)換率等。

（五）流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA合成及含量

流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）是流式細(xì)胞分析所需要的儀器。流式細(xì)胞技術(shù)是集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞免疫螢光技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)的高新細(xì)胞分析技術(shù)，其對(duì)單細(xì)胞快速定量分析和分選。 被測(cè)標(biāo)本（如粒細(xì)胞）經(jīng)特異性熒光染料染色后制成單細(xì)胞懸液加入樣品管中，在氣體的壓力推動(dòng)下進(jìn)入流動(dòng)室。細(xì)胞排成單列，逐個(gè)勻速通過(guò)測(cè)量區(qū)，被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照射后產(chǎn)生散射光并發(fā)出熒光，熒光轉(zhuǎn)化為電子信號(hào)經(jīng)過(guò)特殊的計(jì)算機(jī)軟件儲(chǔ)存、處理后，快速而準(zhǔn)確地獲得形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等多種參數(shù)（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞體積、抗原等），從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的定量分析和分選。

1.DNA合成的檢測(cè)

原理　用5-溴脫氧脲嘧啶（5-bromodeoxyurine，5-BrdU）摻入S期細(xì)胞的DNA，然后用抗5-BrdU抗原的特異性抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)，用FCM準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞的DNA合成速率。

結(jié)果　精確測(cè)定大量細(xì)胞的DNA含量，準(zhǔn)確區(qū)分G1、S、G2+M細(xì)胞周期各時(shí)相分布的動(dòng)態(tài)參數(shù)，間接了解DNA的合成情況。

臨床應(yīng)用

協(xié)助臨床上制定最佳治療方案?；熕幬镏饕饔糜谠鲋称冢⊿、G2 、M）腫瘤細(xì)胞，這樣可將G0期細(xì)胞誘導(dǎo)進(jìn)入增殖期，再予以細(xì)胞殺傷藥物，達(dá)到最佳殺傷腫瘤細(xì)胞的治療效果。

2.DNA含量的測(cè)定

原理　用熒光染料碘化丙啶（propidiu miodide，PI）與雙鏈DNA分子特異性結(jié)合。DNA 的含量與熒光染料的結(jié)合量成正比。經(jīng)PI 染色的 DNA 分子在激光激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，利用FCM將細(xì)胞按不同的熒光強(qiáng)度即DNA含量分類(lèi)并繪出DNA直方圖，從DNA直方圖中可作細(xì)胞周期分析。

結(jié)果　DNA含量隨著細(xì)胞的增殖周期不同而有差異。如果將G0/G1期DNA含量看成 2C，則 G2/M 期應(yīng)為 4C，S 期在2C～4C 之間。DNA 直方圖上第一個(gè)峰表示G0/G1期，第二個(gè)峰表示G2/M期，兩峰之間是S期。

（1）細(xì)胞DNA含量：一個(gè)細(xì)胞群中DNA含量用DNA指數(shù)（DNA index，DI）來(lái)表示相對(duì)含量。根據(jù) DI 值來(lái)判斷細(xì)胞 DNA 倍體的方法是：以正常同源組織細(xì)胞作為樣品2C（2 componets）DNA 含量細(xì)胞的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。DNA 倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)為DI = 0.1±2CV。二倍體（diploid）∶DI = 1.0±2CV（直方圖上僅1個(gè)G0/G1峰）。非整倍體（aneuplid，AN）∶DI值＜0.91，＞1.10。樣品G0 / G1 期DNA 量平均數(shù)DNA指數(shù)（DI）=標(biāo)準(zhǔn)二倍體DNA量平均數(shù)

（2）細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量：包括：G0/G1 期、S 期和 G2-M 期，計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞的百分比。S期細(xì)胞的百分比也叫SPF（S-phase fraction）。

SPF（%）= [ S（G0/G1 + S + G2M）]×100%

細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）（%）=　S + G2-M/G0/G1 + S +（G2-M）×100%

臨床應(yīng)用

細(xì)胞周期分析對(duì)急性白血病的治療和預(yù)后都有一定的意義：① 正常細(xì)胞 DNA 為二倍體（2C），腫瘤細(xì)胞DNA為的非整倍體，從DNA含量分析可了解髓系白血病細(xì)胞的倍體水平和增殖活動(dòng)。② 根據(jù) DNA 直方圖，白血病患者在非治療時(shí)其白血病細(xì)胞G1-S期有阻滯，細(xì)胞DNA百分含量明顯低于正常骨髓細(xì)胞，但治療后好轉(zhuǎn)。S + G2-M期低的患者提示有較長(zhǎng)的生存期；S + G2-M期高者常早期死亡，協(xié)助判斷預(yù)后情況。③SPF 高者對(duì)周期特異性藥物比較敏感，從而可指導(dǎo)臨床用藥，誘導(dǎo)靜止期白血病細(xì)胞進(jìn)入S期，以提高化療效果。

（六）粒細(xì)胞抗體檢測(cè)

1.熒光免疫法

原理　在正常人粒細(xì)胞懸液中加入受檢血清，如血清中有粒細(xì)胞抗體，便與正常人粒細(xì)胞結(jié)合，再加入標(biāo)記有螢光物質(zhì)的兔（羊）抗人免疫球蛋白，可與粒細(xì)胞膜結(jié)合而顯示螢光。

參考值　正常時(shí)血清陰性，有陽(yáng)性反應(yīng)表示受檢血清中有粒細(xì)胞抗體。

臨床應(yīng)用

本方法敏感性較好，特異性強(qiáng)。臨床上常作為確診免疫性 粒細(xì)胞減少的試驗(yàn)。血清粒細(xì)胞抗體常見(jiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Felty綜合征及其他自身免疫性疾病。

2.化學(xué)發(fā)光法

原理　用化學(xué)發(fā)光技術(shù)測(cè)定單個(gè)核細(xì)胞與抗體被覆的粒細(xì)胞相互作用產(chǎn)生的代謝反應(yīng)。間接測(cè)定抗粒細(xì)胞抗體。

參考值　用發(fā)光儀測(cè)定增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用發(fā)光指數(shù)表示結(jié)果。

臨床評(píng)價(jià)

本法比間接螢光免疫法高敏感，可用于確診免疫性粒細(xì)胞減少癥。

3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)

原理　用正常人“O”型抗凝血分離出單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，經(jīng)1%多聚甲醛固定，二者再等量混合制成細(xì)胞懸液，加受檢血清孵育，再加結(jié)合異流氰酸熒光素（fluoresion isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和抗人F（ab）2IgG，，采用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析來(lái)檢測(cè)同種反應(yīng)性粒細(xì)胞抗體。

參考值　熒光強(qiáng)度與粒細(xì)胞抗體量呈線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)螢光強(qiáng)度的大小即可得到粒細(xì)胞抗體的量。

臨床應(yīng)用

本法可對(duì)粒細(xì)胞抗體作半定量測(cè)定及抗體類(lèi)型的分析，以確定是否存在免疫復(fù)合物。

4.白細(xì)胞抗人球蛋白消耗試驗(yàn)

原理　在受檢血的粒細(xì)胞懸液中加入抗人球蛋白抗體，如粒細(xì)胞膜上吸附有不完全抗體，則加入的抗人球蛋白抗體即與之結(jié)合而被消耗。觀察抗人球蛋白效價(jià)在接觸受檢粒細(xì)胞前、后的變化，可間接證明受檢血清中是否有不完全抗體。該試驗(yàn)有直接法和間接法。

參考值　如測(cè)定組效價(jià)低于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組2管或2管以上為陽(yáng)性，表明受檢血清中有不完全抗粒細(xì)胞抗體。正常對(duì)照和鹽水對(duì)照組應(yīng)無(wú)消耗。

臨床應(yīng)用

可間接測(cè)定受檢者血清或粒細(xì)胞表面存在不完全抗體。陽(yáng)性反應(yīng)見(jiàn)于免疫性粒細(xì)胞減少癥、同種輸血反應(yīng)、多次輸血或SLE等。

四、粒細(xì)胞免疫標(biāo)記檢測(cè)

免疫標(biāo)記存在于細(xì)胞表面或胞質(zhì)內(nèi)，其代表某一細(xì)胞種類(lèi)或某一亞群，如表面受體、分化抗原等。粒細(xì)胞在其成熟過(guò)程中抗原的表達(dá)大致分為五個(gè)階段。第一階段骨髓粒細(xì)胞表達(dá)CD34和HLA-DR，CD13和CD33呈高水平表達(dá)。第二階段骨髓粒細(xì)胞CD34和HLA-DR消失；CD33 降低，CD15 表達(dá)增強(qiáng)。第三階段骨髓粒細(xì)胞 CD11b中等水平表達(dá)；CD13消失。第四階段骨髓粒細(xì)胞CD13再次表達(dá)并與CD16呈平行性上升；CD33呈去輕度下降。第五階段骨髓粒細(xì)胞抗原表達(dá)與外周血粒細(xì)胞相同，即CD13、CD16、CD11b、CD45都表達(dá)并達(dá)最高水平。粒細(xì)胞免疫標(biāo)記檢測(cè)有免疫細(xì)胞化學(xué)法、免疫熒光技術(shù)及流式細(xì)胞術(shù)，現(xiàn)在國(guó)際上公認(rèn)流式細(xì)胞術(shù)。

（一）熒光顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)

原理　利用熒光素把抗體蛋白標(biāo)記為熒光抗體。此熒光抗體與細(xì)胞表面的分化抗原相結(jié)合后在熒光顯微鏡特定激發(fā)光的照射下發(fā)出熒光，成為可見(jiàn)的圓形物。有明顯熒光的就有相應(yīng)的抗原存在。以此對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志作出鑒定和定位。熒光抗體法有直接法、間接法及雙標(biāo)記法。

結(jié)果　用+號(hào)表示熒光強(qiáng)度：無(wú)熒光（－）、可疑熒光（±）、熒光清楚可見(jiàn)（+）、熒光明亮（++）、熒光閃亮（+++）～（++++）。

熒光陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)算：陽(yáng)性細(xì)胞率＝熒光陽(yáng)性細(xì)胞/（熒光陽(yáng)性細(xì)胞+熒光陽(yáng)性細(xì)胞）×100%

臨床應(yīng)用

見(jiàn)生物素-親和素酶標(biāo)法。

（二）流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測(cè)

原理　將細(xì)胞標(biāo)本用熒光標(biāo)記制成懸液，一般常用直接三色熒光染色，使熒光標(biāo)記的細(xì)胞逐個(gè)通過(guò)儀器的測(cè)量區(qū)，分別辨認(rèn)細(xì)胞形態(tài)大小和熒光特征，此稱(chēng)為熒光活化細(xì)胞分選法（flow cytomatric cell sorting，F(xiàn)ACS）。流式細(xì)胞儀在短時(shí)間內(nèi)可測(cè)量數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的熒光參數(shù)，用計(jì)算機(jī)記錄處理后快速對(duì)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量分析。

結(jié)果　流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)顯示通常以一維單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點(diǎn)陣圖、二維等高圖（contour）或假三維圖（pseudo 3D）來(lái)表示。單參數(shù)直方圖是一維數(shù)據(jù)應(yīng)用最多的圖形，可用來(lái)定性和定量分析。

臨床應(yīng)用

見(jiàn)生物素-親和素法

（三）堿性磷酸酶-抗-堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法

原理　堿性磷酸酶-抗-堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)（alkaline phosphase antialkaline phosphatase，APAAP）法，是以牛腸堿性磷酸酶作為抗原免疫小鼠，制備小鼠雜交瘤抗堿性磷酸酶單克隆抗體，再與堿性磷酸酶結(jié)合，形成APAAP復(fù)合物。以小鼠雜交瘤單克隆抗體為第一抗體，兔抗-鼠免疫球蛋白為第二抗體（橋），APAAP復(fù)合物為第三抗體。通過(guò)堿性磷酸酶水解底物顯色，達(dá)到抗原定位。

結(jié)果　高倍鏡下計(jì)數(shù) 200 個(gè)有核細(xì)胞，其中細(xì)胞膜上或胞質(zhì)內(nèi)顯示紅色標(biāo)記物為陽(yáng)性，無(wú)紅色標(biāo)記物為陰性。計(jì)算各片陽(yáng)性細(xì)胞百分率，該百分率即分別代表各單抗所指向抗原的陽(yáng)性百分率。陽(yáng)性細(xì)胞 ≥20%為陽(yáng)性結(jié)果。

臨床評(píng)價(jià)

見(jiàn)生物素-親和素法

（四）生物素-親和素酶標(biāo)法

原理　在生物素-親和素酶標(biāo)（avitin-biotin-peroxidase complex，ABC）法中生物素先與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，再與親和素結(jié)合，形成親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，即ABC。細(xì)胞抗原與特異性抗體（第一抗體）結(jié)合后，再與已標(biāo)記上生物素的第二抗體起反應(yīng)，又與ABC結(jié)合。ABC上辣根過(guò)氧化物酶作用于顯色劑，使其產(chǎn)生有色沉淀，確定抗原存在部位。

結(jié)果　計(jì)數(shù)方法同APAAP。

臨床應(yīng)用

抗人白細(xì)胞分化抗原CD系列單克隆抗體與流式細(xì)胞儀和多色熒光染料的聯(lián)合應(yīng)用，已是臨床醫(yī)學(xué)研究的重要方法，其促進(jìn)了血液學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展由于白細(xì)胞分化停滯于某一階段及克隆性異常增殖的結(jié)果，形成白血病的不同亞型。髓系白血?。∕0～M5）的白細(xì)胞分化到不同階段出現(xiàn)不同的細(xì)胞表面標(biāo)記，由此可以對(duì)其進(jìn)行免疫分型。但由于尚缺乏特異性髓系細(xì)胞分化抗原的單抗，也就是缺乏特異性的ANLL亞型免疫標(biāo)志，所以，免疫標(biāo)志應(yīng)用在ANLL的分型尚在探討之中。但白血病細(xì)胞仍然能夠表達(dá)正常粒細(xì)胞的抗原，如：CD33、CD13、CD14、CD11、CD64等。髓系白血病細(xì)胞出現(xiàn)的常見(jiàn)抗原是：CD13、CD33、CD14、CD15、CD68、MPO等。目前對(duì)髓系白血病免疫分型常用的抗原是CD13、CD33、CD15、CD45、HLA-DR、CD34、CD7、CD3及抗髓過(guò)氧化物酶（MPO），MPO對(duì)髓系白血病M0～M5的診斷具有重要價(jià)值。CD45是白細(xì)胞的共同抗原，其細(xì)胞表面的表達(dá)量與細(xì)胞的分化程度有關(guān)，原、幼細(xì)胞的表達(dá)量比成熟細(xì)胞低，由此可鑒別出原、幼細(xì)胞的數(shù)量，再結(jié)合其他免疫標(biāo)志共同分析有利于白血病亞型的正確診斷。在急白M0型時(shí)至少表達(dá)一個(gè)髓系抗原，MPO比CD13、CD33更敏感。CD13在原始粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)比膜上早，這在急性髓性白血病（AML）的診斷上有重要意義；相當(dāng)一部分急性白血病M2患者表達(dá)CD15；約90%的AML白血病細(xì)胞表達(dá)CD117。急性白血病時(shí)，粒（髓）細(xì)胞免疫標(biāo)志應(yīng)用其亞性的鑒別有尤其是對(duì) M0 型的診斷；此外，應(yīng)用于與急性淋巴細(xì)胞白血病鑒別及急性雙表型白血病的診斷。