實(shí)驗(yàn)二　生物素－親和素技術(shù)：BAS－ELISA測(cè)定抗－HBs

在免疫酶技術(shù)中，可利用生物素－親和素系統(tǒng)（biotin－avidin system，BAS）標(biāo)記抗體，即BAS－ELISA技術(shù)，是一種新型生物放大技術(shù)，它使用生物素－親和素－過(guò)氧化物酶雙抗體夾心復(fù)合物作為指示劑，可進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感度。生物素（biotin）是廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)的一種生長(zhǎng)因子，又稱輔酶R或維生素H。親和素（avidin）是卵白及某些微生物中的一種蛋白質(zhì)，由4個(gè)亞單位組成。二者有高度親和力，且均能偶聯(lián)抗體、抗原和辣根過(guò)氧化物酶而不影響其生物學(xué)活性。

在生物素－親和素系統(tǒng)中，借助所形成的親和素－生物素－酶復(fù)合物，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)酶催化底物顯色，可檢出相應(yīng)的抗體或抗原。由于抗原或抗體分子可偶聯(lián)多個(gè)生物素，且1個(gè)親和素分子可結(jié)合4個(gè)生物素分子，組成新的生物放大系統(tǒng)，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。目前，BAS技術(shù)已在整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研究工作中最具使用價(jià)值和發(fā)展前途的技術(shù)之一。

BAS－ELISA用于檢測(cè)的基本方法有以下三種：BA法或標(biāo)記親和素生物素法（LAB）、BAB法或橋聯(lián)親和素－生物素法（BRAB）和ABC法。

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（1）掌握BAS－ELISA測(cè)定抗－HBs實(shí)驗(yàn)原理。

（2）熟悉其操作方法、應(yīng)用及臨床意義。

實(shí)驗(yàn)原理

BAS－ELISA檢測(cè)抗－HBs實(shí)驗(yàn)是采用ELISA間接法結(jié)合生物素－親和素系統(tǒng)試劑，檢測(cè)血清或血漿中抗－HBs水平。將包被有乙肝病毒表面抗原（HbsAg）的聚苯乙烯微量反應(yīng)板各孔與標(biāo)本一起溫育。如果標(biāo)本中有抗體，即與固相抗原反應(yīng)。洗去未結(jié)合物，加標(biāo)有生物素的抗人IgG單克隆抗體（B－MAHG），以形成固相HbsAg—抗－HBs—BMAHG復(fù)合物。洗去未結(jié)合的B－MAHG，加親和素－生物素化辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC），洗去未結(jié)合的ABC，再加含有過(guò)氧化氫和鄰苯二胺（OPD）的底物，底物被水解后其顏色深淺與標(biāo)本抗－HBs的含量相一致。

實(shí)驗(yàn)材料

（1）商品化BAS－ELISA檢測(cè)抗－HBs試劑盒。

①HBsAg（溶入含50%甘油的PBS中）。

②B－MAHG（溶入含50%甘油的PBS中）。

③ABC（溶入含50%甘油的PBS中）。

④陰性對(duì)照血清（3瓶）。

⑤陽(yáng)性對(duì)照血清（1瓶）。

⑥OPD結(jié)晶。

⑦濃縮的HBsAg稀釋劑。

⑧洗滌液。

⑨底物緩沖液。

⑩新生小牛血清。

〇11聚苯乙烯微量反應(yīng)板。

（2）待檢標(biāo)本、3%過(guò)氧化氫、2mol/L硫酸、水浴箱、微量移液器、吸頭及酶標(biāo)檢測(cè)儀等。

實(shí)驗(yàn)方法

（1）包被　將1mL HBsAg稀釋劑和9mL蒸餾水吸入干凈試管中，將全部HBsAg溶液移入試管混勻后，加入聚苯乙烯微量反應(yīng)板100μL/孔。將微孔板置于濕盒內(nèi)，置于37℃水浴2h或于4℃處過(guò)夜，洗滌3次（洗滌方法同“ELISA雙抗體夾心法測(cè)HBsAg”步驟“3”手工洗滌）。

（2）封閉　將全部濃縮洗滌液移入1個(gè)干凈燒杯，加入490mL蒸餾水，混勻后于37℃水浴2h即為洗滌液。將5mL HBsAg稀釋劑、5mL新生小牛血清和40mL蒸餾水移入1個(gè)干凈燒杯混勻即為封閉液。各孔加100μL封閉液。37℃水浴2h，洗滌3次（方法同上）。

（3）加樣　分別將100μL陰性（3孔）和陽(yáng)性（1孔）對(duì)照樣品加入反應(yīng)孔內(nèi)。吸取100μL待檢標(biāo)本加于各反應(yīng)孔。將聚苯乙烯微量反應(yīng)板置于37℃水浴1h，洗滌3次（方法同上）。

（4）加B－MAGH　將全部B－MAHG溶液移入一個(gè)干凈試管，加10mL封閉液并徹底混勻，各孔加100μL，置于37℃水浴45min，洗滌3次（方法同上）。

（5）加ABC　將全部ABC溶液移入一干凈試管，加10mL封閉液并徹底混勻，各孔加100μL，置于37℃水浴30min，洗滌3次（方法同上）。

（6）加底物　將5mg OPD溶于10mL底物緩沖液，加150μL 3%過(guò)氧化氫混勻，各孔加100μL，置于37℃溫育10min。

（7）測(cè)定　各孔加100μL 2mol/L硫酸以終止酶反應(yīng)。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上以空白孔調(diào)零（492nm波長(zhǎng)），測(cè)定各孔的OD值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將未知標(biāo)本的凈吸光度與閾值作比較，以確定是否存在抗－HBs。閾值是由陰性對(duì)照孔吸光度均值（An）與其三倍標(biāo)準(zhǔn)差之和確定的，見(jiàn)表4－1。

表4－1　陰性對(duì)照樣品的吸光度值

An＝0．071，SD＝0．019，閾值＝An＋3×0．019＝0．128。

凡標(biāo)本的吸光度（As）大于或等于閾值時(shí)，被認(rèn)為具有抗－HBs反應(yīng)性。若As小于閾值，則認(rèn)為無(wú)抗－HBs反應(yīng)性。

注意事項(xiàng)

（1）試劑應(yīng)低溫保存。且OPD和ABC應(yīng)避免暴露在強(qiáng)光之下。

（2）底物液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配且應(yīng)避光放置。

（3）每次實(shí)驗(yàn)須作陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

思考題

（1）請(qǐng)分析一下BAS－ELISA法與ELISA法，前者靈敏度提高的原因是什么？

（2）簡(jiǎn)述檢測(cè)血清或血漿中抗－HBs水平的臨床意義。