3.10　口蹄疫常用檢測方法

3.10.1　口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（FMD 3ABC-I-ELISA）

1.用途　FMD 3ABC-I-ELISA試劑盒（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)）檢測FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。該試劑盒不受血清型影響，適用于活畜進(jìn)出口調(diào)運(yùn)、疫區(qū)凈化檢疫和群體無癥狀感染評(píng)價(jià)，區(qū)分感染和免疫動(dòng)物。本診斷試劑盒可測出牛感染后長達(dá)480天（16個(gè)月）的FMDV感染抗體。

2.原理　FMD 3ABC-I-ELISA試劑盒采用間接ELISA模式。用3ABC基因表達(dá)蛋白包被ELISA板，洗板封閉。加入待檢血清樣品，如果血清樣品中有3ABC抗體，與ELISA板上3ABC蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底物后，就會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)。如果待檢樣品為陰性，就不能形成抗原-抗體復(fù)合物，酶標(biāo)二抗不會(huì)結(jié)合，因此就不顯色。

3.注意事項(xiàng)　冰凍血清樣品應(yīng)充分融化，且應(yīng)混合均勻。

血清稀釋液和底物應(yīng)平衡至室溫應(yīng)用。底物A在4℃為結(jié)晶狀態(tài)，需要在室溫或37℃水浴狀態(tài)溶解后應(yīng)用。最好在血清稀釋板上稀釋血清，以減少操作誤差。

應(yīng)使用相同的加樣器加樣，以保證加樣量的準(zhǔn)確，減少試驗(yàn)誤差。

多道微量移液器所用的吸頭應(yīng)為同一規(guī)格和型號(hào)，避免加樣誤差。

應(yīng)使用自動(dòng)或手動(dòng)連續(xù)洗板系統(tǒng)洗板。

加樣先后次序應(yīng)該一致，保證作用時(shí)間一樣。

底物作用時(shí)間到后，如果顏色較淺，可適當(dāng)延長作用時(shí)間。

4.試劑準(zhǔn)備　將試劑盒配備的25倍濃縮PBST用無離子水或蒸餾水做1:25倍稀釋即可。

5.操作步驟

一是待檢血清樣品和陽性、陰性對(duì)照血清用血清稀釋液1:21稀釋（120μl血清稀釋液加血清6μl），每孔加入100μl，陰、陽性對(duì)照血清樣品平行加兩孔，用封口膜封口，37℃結(jié)合30分鐘。

二是取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。

三是用血清稀釋液按1:1000稀釋酶標(biāo)二抗，每孔加入100μl，用封口膜封口，37℃結(jié)合30分鐘。

四是取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。

五是將底物A按1:50比例（體積比）稀釋于底物B中（1毫升底物B中加入20μl底物A），吹打混勻，每孔加入100μl，封口膜封口，37℃避光作用10～15分鐘。

六是每孔加入100μl終止液。

七是輕輕搖振混勻，測定波長450nm吸光值（OD450值）。

八是陽性對(duì)照平均OD值應(yīng)大于0.6，陰性對(duì)照平均OD值應(yīng)小于0.2。

九是結(jié)果計(jì)算。樣品效價(jià)為（OD樣品-OD陰性）/（陽性-OD陰性）。

6.結(jié)果判定若效價(jià)＜0.2，為陰性；效價(jià)在0.2～0.3之間為可疑；效價(jià)＞0.3為陽性?？梢珊完栃詷悠窇?yīng)進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測為可疑和陽性時(shí)，應(yīng)判為陽性。

3.10.2　口蹄疫抗體液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（LB-ELISA）

1.原理　口蹄疫抗體液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（LB-ELISA）診斷試劑盒（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)）是將預(yù)先滴定好的固定量病毒抗原與被檢血清首先在液相中反應(yīng)，然后將抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到包被了FMD型特異性抗體的ELISA板中，沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被ELISA板中的抗體捕獲，亦與隨后加入的豚鼠抗血清中的抗體結(jié)合，再通過兔抗豚鼠IgG酶結(jié)合物和底物溶液顯色。按試驗(yàn)孔呈現(xiàn)的顏色與抗原對(duì)照（未加血清）孔呈現(xiàn)顏色相比較判定結(jié)果?？贵w滴度以能阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示?？谔阋咭合嘧钄郋LISA診斷試劑盒液相阻斷ELISA是國際獸疫局（OIE）推薦的檢測口蹄疫病毒抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.試劑與器材

試劑

捕獲抗體：兔抗口蹄疫病毒146S血清

檢測抗體：豚鼠抗口蹄疫病毒146S血清

病毒抗原及病毒對(duì)照抗原：用BEI滅活的病毒細(xì)胞培養(yǎng)物

標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清

酶結(jié)合物：兔抗豚鼠IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物

底物溶液：鄰苯二胺（OPD）/H₂O₂溶液

終止液：1.25mol/L H₂SO₄

緩沖液：

包被緩沖液：0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃，pH9.6

稀釋液：0.05%（V/V）Tween-20加入0.01M PBS,pH7.4（PBST）

豚鼠抗血清稀釋液：10%牛血清-5%兔血清-PBST

洗滌液：0.01M PBST,pH7.4

儀器材料

ELISA板：96孔平底聚苯乙烯ELISA板

抗原抗體反應(yīng)板：96孔U型底聚苯乙烯微量板

移液器：0.5～20μl，5～40μl，50～200μl，200～1000μl可調(diào)移液器各一把，8道或12道移液器1把，移液槽5～6個(gè)，配套移液槍尖若干。

生化培養(yǎng)箱1個(gè)

酶標(biāo)儀：492nm波長濾光片

吸水紙巾

3.操作步驟

（1）在U型血凝板上按50μl/孔量用PBST工作液將待檢血清從1:4開始做2倍稀釋至1:512。然后每孔加入50μl用PBST稀釋到使用濃度（1:5）的病毒抗原，震蕩混勻，4℃過夜。加入病毒抗原后血清的實(shí)際稀釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍連續(xù)稀釋度。

（2）將血清-抗原復(fù)合物移入ELISA板內(nèi)，每孔50μl，37℃，60分鐘溫浴。

（3）用PBST洗板5次。每孔加50μl用豚鼠抗血清稀釋液稀釋至使用濃度（1:1600）的豚鼠抗血清，37℃，60分鐘溫浴。

（4）用PBST洗板5次，每孔加50μl用PBST稀釋至使用濃度（1:2000）的兔抗豚鼠IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物，37℃，60分鐘溫浴。

（5）用PBST洗板5次，每孔加50μl鄰苯二胺（OPD）/H₂O₂溶液，37℃，15分鐘溫浴后，每孔再加入50μl終止液終止反應(yīng)，以492nm波長測定OD值。

4.對(duì)照的設(shè)立與結(jié)果的判定

一是標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清對(duì)照：用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清替代待檢血清進(jìn)行上述試驗(yàn)，OD值應(yīng)隨著稀釋度的增加而有規(guī)律地升高，以顯示試驗(yàn)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。陽性血清滴度1:2048±1個(gè)滴度、陰性血清滴度小于1:4成立。

二是病毒抗原對(duì)照：每次試驗(yàn)每塊板設(shè)4孔用PBST稀釋至使用濃度（1:5）的病毒抗原對(duì)照，不加待檢血清，其他步驟完全同上述程序。病毒抗原對(duì)照至少2孔的OD值在1.0～1.5時(shí)，試驗(yàn)成立。

三是結(jié)果判定：以病毒抗原對(duì)照平均OD值的50%為臨界值，被檢血清OD值大于臨界值的孔為陰性孔，小于臨界值的為陽性孔，陽性孔的OD值等于臨界值時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。如果病毒抗原對(duì)照平均OD值為1.2，則其50%為0.6。若一待檢血清在1:128時(shí)OD值為0.6，則該份待檢血清的抗體滴度為1:128?？贵w滴度＜16陰性，＞32陽性，16～32可疑。ELISA抗體滴度與免疫動(dòng)物攻毒保護(hù)的關(guān)系：牛、羊≥1:128 100%保護(hù)，＜16不保護(hù)，22～90 50%保護(hù)。