血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳_生物化學實驗技術

實驗項目一　血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳

學習目標

【知識目標】

（1）能夠準確描述醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理。

（2）能用自己的語言描述血清中各種蛋白質(zhì)的成分和相對百分含量。

（3）能夠簡要描述醋酸纖維素薄膜電泳的內(nèi)容及操作要點。

【能力目標】

（1）能在規(guī)定時間內(nèi)正確完成實驗操作內(nèi)容，做到步驟正確。

（2）能夠學會人及動物血清的制備，并能說出血清與血漿的區(qū)別。

（3）能夠熟練使用電泳儀、電泳槽。

（4）能夠準確判斷在什么情況下需要患者進行血清蛋白質(zhì)醋酸纖維素薄膜電泳，說明其能輔助診斷哪些臨床疾病。

患者，女，42歲，面色蒼白，雙腿進行性水腫。臨床檢查結果：血壓正常，肺部聽診有濁音，血清蛋白質(zhì)電泳圖譜中清蛋白區(qū)帶明顯變小、變淺，血清白蛋白降低，α₂－球蛋白、β－球蛋白則升高；尿白蛋白（＋）。請初步診斷是什么??？

（提示：腎病綜合征）

【實驗原理】

醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素薄膜做固體支持物的電泳技術。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基經(jīng)乙酰化所形成的纖維素醋酸酯，將其溶解在有機溶劑中，并涂成均勻的薄膜，具有均一的泡沫結構，厚度僅120μm。醋酸纖維素薄膜作為電泳支持物具有對各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶等）幾乎完全不吸附，同時對染料也沒有吸附，因此不結合的染料能完全洗掉，無樣品處幾乎完全無色的優(yōu)點。醋酸纖維素薄膜電泳與紙電泳相似，且是在其基礎上發(fā)展起來的。該電泳具有比

案例引導

紙電泳電滲小、分離速度快、樣品用量小（可少于10μL），而分辨率高和分離清晰等優(yōu)點。因此，從1956年Kohn首先應用此法以來，紙電泳已逐漸被其取代。醋酸纖維素薄膜電泳的操作方法除比瓊脂電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳簡便外，還有一個顯著優(yōu)點，即染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和進行定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、多肽、核酸、同工酶及其他生物大分子的分析檢測，是醫(yī)學和臨床檢驗的常規(guī)技術。

由于以醋酸纖維素薄膜進行蛋白電泳有諸多優(yōu)點，故常采用此種方法分離血清蛋白質(zhì)并加以定量。血清中含有多種蛋白質(zhì)，在本實驗中分離的主要有清蛋白（又稱白蛋白）、α₁－球蛋白、α₂－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白。其等電點各不相同，大多在4.64～7.3之間。

蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，在不同pH值條件下，其帶電情況不同。在等電點時，蛋白質(zhì)為兼性離子，其凈電荷為零，在電場中不發(fā)生泳動；蛋白質(zhì)分子在pH值小于其等電點的溶液中，呈堿式解離，帶正電荷，在電場中向負極泳動；蛋白質(zhì)分子在pH值大于其等電點的溶液中，呈酸式解離，帶負電荷，在電場中向正極泳動。根據(jù)Stoke定律，假定帶電粒子為球形，帶電粒子在電場中的電泳速度用下列公式表示。

式中：Q為帶電荷量；E為電場強度；6π為帶電粒子的經(jīng)驗半數(shù)；r為分子半徑；η為黏度系數(shù)。

由此可知，帶電粒子的泳動速度除與電場強度和溶液性質(zhì)有關外，主要取決于帶電粒子的電荷量以及顆粒的大小與形狀。

血清蛋白質(zhì)種類不同，其分子質(zhì)量、大小、形狀各不相同，等電點也不同。因此，在同一pH值溶液中，可解離成帶有不同電荷的離子，而在電場作用下，以不同的電泳速度聚集在不同的位置，在支持介質(zhì)上呈現(xiàn)出不同的電泳區(qū)帶，從而實現(xiàn)分離血清中各種不同蛋白質(zhì)成分的目的。

本實驗電泳系統(tǒng)采用的是pH值為8.6的巴比妥緩沖液，該溶液的pH值大于血清中蛋白質(zhì)的等電點，使得血清蛋白質(zhì)均帶負電荷，在恒定的電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，分子所帶的凈電荷（Q）及形狀、大小（r）各不相同。因此，在電場中泳動的速度也不同，在相同的時間內(nèi)，移動的距離不同，在電泳介質(zhì)上產(chǎn)生不同的電泳區(qū)帶，故可將其分離。分離后的蛋白質(zhì)用氨基黑10B染色，漂洗后，醋酸纖維素薄膜上便呈現(xiàn)出不連續(xù)的區(qū)帶即蛋白電泳圖譜，從正極端起，分別為清蛋白（白蛋白）、α₁－球蛋白、α₂－球蛋白、β－球蛋白及γ－球蛋白。由于蛋白質(zhì)含量與吸附的染料有一定正比關系，據(jù)此，剪下各條譜帶，用堿液洗下蛋白質(zhì)吸附的染料，進行比色分析，即可求出血清樣品中各區(qū)帶蛋白質(zhì)的相對百分比。此外，也可對透明處理過的電泳圖譜進行掃描分析，自動繪出區(qū)帶吸收峰，依據(jù)掃描曲線中各區(qū)帶的面積與總面積之比，亦可計算出各區(qū)帶蛋白質(zhì)的百分含量。表3－1列出了幾種常見血清蛋白質(zhì)的等電點及平均相對分子質(zhì)量。

表3－1　幾種常見血清蛋白質(zhì)的等電點及平均相對分子質(zhì)量

【實驗器材】

電泳儀，電泳槽，醋酸纖維素薄膜（2×8cm²），培養(yǎng)皿，點樣器，粗濾紙條，鉛筆，直尺，鑷子，染色缸，漂洗缸，載玻片。

【藥品及試劑】

巴比妥緩沖液（pH＝8.6，離子強度0.6），染色液，漂洗液，洗脫液，透明液，新鮮血清。

【試劑配制】

1.巴比妥緩沖液（pH＝8.6，離子強度0.6）

巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g加蒸餾水數(shù)百毫升，加熱溶解后再補加蒸餾水至1000mL，混勻。

2染色液

氨基黑10B0.5g，溶于甲醇50mL中，再加冰醋酸10mL、蒸餾水40mL混勻。

3.漂洗液

甲醇（或95%乙醇）45mL，冰醋酸5mL，蒸餾水50mL混勻。

4.洗脫液

0.4mol/L氫氧化鈉溶液。

5.透明液

95%乙醇20mL，冰醋酸5mL混勻。

操作流程

【操作步驟】

1.浸膜

用鑷子取醋酸纖維素薄膜1張（識別光澤面和粗糙面，并在一角用筆標記），小心平放在盛有巴比妥緩沖液的平皿中，使膜充分浸透下沉，約30min。

2.點樣

（1）將充分浸透的膜取出，用干凈的兩張濾紙吸去多余的緩沖液，醋酸纖維素薄膜粗糙面向上，用鉛筆在距左側邊緣一端1.5～2.0cm處畫一條點樣線（圖3－1）。

圖3－1　醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣線位置示意圖

注：虛線處為點樣線位置。

（2）用點樣器在盛有血清的表面皿中蘸一下，使點樣器下端粘上薄層血清，再將點樣器輕輕地印在點樣線上，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細均勻的直線。

3.電泳

醋酸纖維素薄膜電泳裝置示意圖如圖3－2所示。將點樣后的膜置于電泳槽架上，放置時膜暗面（即點樣面）向下，點樣端置于陰極，槽架上以四層濾紙（或紗布）作橋墊，膜條與濾紙需貼緊，將膜擺平拉直，蓋好電泳槽蓋平衡5min。

圖3－2　醋酸纖維素薄膜電泳裝置示意圖

檢查電泳槽電極的連接正確無誤后通電，調(diào)節(jié)電流，按總膜寬計算，每厘米寬給電流0.4～0.6mA，通電時間45～60min。

4.染色

通電完畢后，立即用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B染色液的染色缸中，浸染5～10min，然后移放漂洗液中漂洗數(shù)次，至蛋白條帶清晰、本底無色為止，取出薄膜用濾紙吸干。

5.定量

將漂洗干凈的膜夾在濾紙中吸干，剪下各蛋白區(qū)帶及一段平均大小的空白區(qū)，分別依次放入試管中，標清管號，向清蛋白管內(nèi)加入0.4mol/L NaOH 10mL，其余各管加0.4mol/L NaOH 5mL，輕輕振搖，使著色完全洗脫于溶液中，用620nm波長比色，記取各管光密度值。

6.透明

將脫色后的薄膜浸入透明液中，浸泡2～3min后，取出緊貼于潔凈載玻片（或玻璃板）上，兩者間不能有氣泡，干后即為透明的薄膜。

【實驗數(shù)據(jù)處理及結果分析】

1.直觀觀察

用肉眼觀察，在膜上有五條區(qū)帶出現(xiàn)。從正極端起分別是清蛋白（A）、α₁－球蛋白（α₁）、α₂－球蛋白（α₂）、β－球蛋白（β）、γ－球蛋白（γ）。可按染色區(qū)帶位置進行定性觀察，其分析結果如圖3－3所示。

圖3－3　血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結果定性分析示意圖

2.定量分析

（1）計算各組分相對百分比。計算方法如下。

正常參考值（相對百分比）：

清蛋白　　　　　57%～72%

α₁－球蛋白　　 2%～5%

α₂－球蛋白　　 4%～9%

β－球蛋白　　　6.5%～12%

γ－球蛋白　　　12%～20%

（2）計算出清蛋白與球蛋白之比值（A/G）。

（3）也可以直接用透明后的膜進行光密度掃描法來測定各組分的相對百分比。將干燥的血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜放入自動掃描光密度儀（或色譜掃描儀）內(nèi)，通過反射（使用未透明的薄膜時）或透射（用已透明的薄膜時）方式，在記錄器上自動繪出血清蛋白質(zhì)各組分曲線圖，橫坐標為膜的長度，縱坐標為光密度（或光強度），每一個峰代表一種蛋白質(zhì)組分。然后，用求積儀測量出各峰的面積，計算每個峰的面積與它們總面積的百分比就代表血清中各種蛋白質(zhì)組分的相對百分比。或將曲線圖上各峰沿曲線剪下，稱量各峰的重量，計算每個峰的重量與它們總重量的百分比也可以代表血清中各種蛋白質(zhì)組分的相對百分比。在使用具有電子計算機附件的自動掃描光密度儀時，可以由顯示部分或打字帶上獲得血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜上每條區(qū)帶所代表的蛋白質(zhì)組分的含量（圖3－4）。

圖3－4　血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結果定量分析示意圖

【注意事項】

（1）市售的醋酸纖維素薄膜都是干燥的膜片，薄膜是否浸潤完全是電泳成敗的關鍵因素。若飄浮于液面的薄膜在15～30s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜制作均勻可用于電泳。醋酸纖維素薄膜在電泳前，一定要用緩沖液充分浸泡。如果條件允許至少要求浸泡2h，過夜更好。

（2）醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH值為8.6巴比妥－巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.05～0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關。如果緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，會導致區(qū)帶擴散變寬；如果緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，會導致區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。此外，多次電泳后，由于水分蒸發(fā)，緩沖液的離子強度會發(fā)生改變。因此，每次電泳后應交換正、負極兩側的電泳緩沖液，并補足蒸發(fā)掉的水量，多次電泳后應換新的緩沖液。

（3）點樣時，因為醋酸纖維素薄膜承載蛋白質(zhì)量有限，加樣量不宜過多。應將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴散。但不宜太干，否則樣品不易進入膜內(nèi)，造成點樣起始點參差不齊，從而影響分離效果。

（4）點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。

（5）鋪膜時，為防止指紋污染，應戴手套。應注意暗面向下，點樣端置于負極側。因血清蛋白在pH值為8.6的緩沖液中全部帶負電荷，電泳時會向正極移動；若點樣端誤置于正極，經(jīng)過一定時間電泳后，蛋白質(zhì)將移出醋酸纖維素薄膜。同時，鋪膜時醋酸纖維素薄膜長邊應與電力線嚴格保持平行，兩端應分別與正、負極鹽橋緊密接觸并拉平膜面。

（6）電泳時應選擇合適的電流強度，一般電流強度為0.4～0.6mA/cm膜寬度。電流強度高，則熱效應高；電流強度過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。此外，電泳膜兩端電壓應控制在120V左右，不能過高。

【實驗意義】

（1）正常值：清蛋白（白蛋白）/球蛋白＝（1.5～2.5）∶1。

（2）意義：血清中蛋白質(zhì)的種類很多，它們大多在肝內(nèi)合成，但生理功能各不相同。在正常情況下，由肝臟合成的清蛋白（又稱白蛋白）、α－球蛋白、β－球蛋白，在血清中的濃度常在一定范圍內(nèi)波動，且A（清蛋白）/G（球蛋白）比值維持在1.5～2.5之間。但在某些病理條件下，血清蛋白的含量常發(fā)生改變。因此，血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳在臨床上常用于分析血、尿等樣品中的蛋白質(zhì)含量，以供臨床上肝、腎等疾病輔助檢驗參考。

①腎病綜合征、急慢性腎炎、腎功能衰竭等患者，血漿蛋白中小分子量的清蛋白漏出且隨尿液排出體外，導致醋酸纖維素薄膜電泳圖譜中清蛋白區(qū)帶明顯變小、變淺，血液中清蛋白含量降低，而α₂－球蛋白、β－球蛋白含量升高。

②急、慢性肝炎和肝硬化患者，由于肝細胞受損，肝臟合成血漿蛋白的能力大大下降，使血漿中的清蛋白含量顯著降低，其球蛋白總量則明顯升高，β－球蛋白和γ－球蛋白含量增高，故A/G比值下降，甚至可出現(xiàn)清蛋白含量小于球蛋白含量，從而使A/G比值小于1，這種情況稱為清/球倒置。肝硬化患者，有時也會出現(xiàn)β－球蛋白和γ－球蛋白難分離而相連的“β～γ橋”，此現(xiàn)象往往是由于IgA增高所致，IgA與肝纖維化有關。

③在多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、重鏈病患者血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜中可見不正常的球蛋白條帶。整個球蛋白條帶可分離出6條區(qū)帶，在β－球蛋白與γ－球蛋白后區(qū)段的各部分出現(xiàn)1條致密濃集的條帶，為M蛋白帶。多發(fā)性骨髓瘤在表3－2列出的疾病中可見醋酸纖維素薄膜蛋白電泳圖明顯異常。

④臍帶血清、胎兒血清、部分原發(fā)性肝癌患者血清，在清蛋白與α₁－球蛋白之間可增加1條甲胎蛋白帶。

表3－2　血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳條帶異常與疾病

能力檢測

一、單項選擇題

1.正常人血清A/G之比應為（　　）。

A.1.5∶1　　B.（1.5～2.5）∶1　　C.2.5∶1

D.1∶（1.5～2.5）　　E.3∶1

2.血清中清蛋白含量下降常見于許多病理情況，但下列哪種情況除外？（　　）

A.手術后　　　　B.腸胃功能紊亂　　C.營養(yǎng)不良

D.腎病綜合征　　E.急性肝炎早期

3.在腎病綜合征中，下列哪種蛋白含量可出現(xiàn)升高？（　?。?/p>

A.清蛋白　　B.α₁－球蛋白　　C.α₂－球蛋白

D.脂蛋白　　E.γ－球蛋白

4.下列關于肝硬化患者血清蛋白電泳結果描述不正確的是（　　）。

A.A/G之比為（1.5～2.5）∶1

B.清蛋白含量顯著降低，其球蛋白總量則明顯升高

C.β－球蛋白和γ－球蛋白含量增高

D.A/G比值小于1，稱為清/球倒置

E.有時也會出現(xiàn)β－球蛋白和γ－球蛋白條帶相連