體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性_動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)2　體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)特性

體外培養(yǎng)的組織細(xì)胞源于生物體內(nèi)，其生物學(xué)特征具有兩重性。一方面，它的基本生物學(xué)特征仍與體內(nèi)細(xì)胞的相似；另一方面，培養(yǎng)物在體外條件下生長，由于生長環(huán)境的差異，尤其是失去了有機(jī)體整體的生長調(diào)節(jié)機(jī)制，許多生長生物學(xué)行為將會(huì)發(fā)生改變，形成了其特有的生長、分化及增殖規(guī)律。

一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型

體外培養(yǎng)的細(xì)胞，按其生長方式可分為貼附生長型與懸浮生長型兩大類。

1.貼附生長型細(xì)胞

貼附生長型細(xì)胞為能附著于底物（支持物）表面生長的細(xì)胞，又稱為貼壁依賴性細(xì)胞?；铙w體內(nèi)的細(xì)胞當(dāng)被置于體外培養(yǎng)時(shí)大多數(shù)以貼附型方式生長。

目前已有很多種細(xì)胞能在體外培養(yǎng)生長，這些細(xì)胞在活體體內(nèi)時(shí)，各自具有其特殊的形態(tài)，但是處于體外培養(yǎng)狀態(tài)下的貼附生長型細(xì)胞則常在形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去其在體內(nèi)原有的某些特征。貼附生長的體外培養(yǎng)的細(xì)胞從形態(tài)上大體可分為以下幾類（圖1-5）。

圖1-5　細(xì)胞的不同形態(tài)

（a）上皮型細(xì)胞；（b）成纖維型細(xì)胞；（c）游走型細(xì)胞；（d）多形型細(xì)胞

（1）上皮型細(xì)胞。這類細(xì)胞在形態(tài)上多呈扁平不規(guī)則多角形，卵圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞質(zhì)的中央，細(xì)胞緊密相靠、互相銜接成片，或呈鑲嵌狀緊密排列，相互擁擠而呈現(xiàn)“鋪路石”樣。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞（如皮膚表皮及其衍生物，消化管上皮，肝、胰、肺泡上皮等的細(xì)胞）皆為上皮型細(xì)胞。

（2）成纖維型細(xì)胞。起源于中胚層的組織細(xì)胞，體外培養(yǎng)時(shí)屬于此類，如纖維結(jié)締組織、平滑肌、心肌、血管內(nèi)皮等在體外培養(yǎng)條件下都為成纖維型細(xì)胞。這類細(xì)胞的形態(tài)為纖維狀，具有長短不等的數(shù)個(gè)細(xì)胞突起，因而多呈梭形、不規(guī)則三角形或扇形，核靠近細(xì)胞質(zhì)的中央。其生長特點(diǎn)為，細(xì)胞不緊靠相連成片，而是排列為旋渦狀、放射狀或柵欄狀。

（3）游走型細(xì)胞。游走型細(xì)胞在支持物上呈散在生長，一般不連成片，細(xì)胞質(zhì)常伸出偽足或突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)速度快而方向不規(guī)則，此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

（4）多形型細(xì)胞。多形型細(xì)胞由于難以確定其形態(tài)而得名，如神經(jīng)細(xì)胞，難以確定其穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

以上分類僅是為了實(shí)際工作的方便而進(jìn)行的籠統(tǒng)提法。體外的細(xì)胞不能等同于體內(nèi)相應(yīng)類型的細(xì)胞，僅是其形態(tài)與體內(nèi)的上皮細(xì)胞的形態(tài)類似，而且僅是描述細(xì)胞的外形而并非說明細(xì)胞的起源，兩種形態(tài)類似的細(xì)胞可能來自不同性質(zhì)的細(xì)胞亞類。取自不同組織的上皮細(xì)胞，其生化特征及其原來的形態(tài)會(huì)有差異，而來自不同組織的形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，其發(fā)展的趨向可能并不相同。例如，可從脾臟及骨髓分別分離出形態(tài)相似的“成纖維細(xì)胞”，當(dāng)接種這些細(xì)胞于同源的動(dòng)物時(shí)，只有那些來自骨髓的“成纖維細(xì)胞”才有可能形成骨樣組織。因此，采用上皮樣細(xì)胞或成纖維樣細(xì)胞這樣的名詞更為恰當(dāng)。此外，體外培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)并不完全恒定，可因各種因素而發(fā)生改變，包括pH值、細(xì)胞密度、污染等的影響。例如，Vero細(xì)胞（圖1-6）本身是上皮型細(xì)胞，但若培養(yǎng)的環(huán)境酸性或堿性過強(qiáng)，則可呈現(xiàn)為梭形而似成纖維細(xì)胞；有些細(xì)胞在高血清濃度生長時(shí)為細(xì)長的成纖維細(xì)胞狀，在低血清濃度生長時(shí)則更似上皮細(xì)胞。

圖1-6　Vero細(xì)胞

2.懸浮生長型細(xì)胞

少數(shù)類型的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不需要附著于底物而在懸浮狀態(tài)下即可生長，包括一些取自血、脾或骨髓的細(xì)胞（尤其是血液細(xì)胞）以及癌細(xì)胞。這些細(xì)胞在懸浮狀態(tài)生長良好，多呈圓形。由于懸浮生長于培養(yǎng)液之中，因此其生存空間大，具有能夠提供大量細(xì)胞、傳代繁殖方便（只需稀釋而不需消化處理）、易于收獲等優(yōu)點(diǎn)，并且適于進(jìn)行血液病的研究。其缺點(diǎn)是不如貼附生長型細(xì)胞觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細(xì)胞都能懸浮生長。圖1-7所示為懸浮生長的紅細(xì)胞。

圖1-7　懸浮生長的紅細(xì)胞

二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)

細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長時(shí)具有一些特點(diǎn)，突出的特點(diǎn)是貼附、接觸抑制和密度抑制。

1.貼附

貼附并伸展是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長特點(diǎn)。雖然血細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）在活體體內(nèi)并無聚集的傾向并在體外可于懸浮狀態(tài)下生長，但是大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長，這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般呈球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細(xì)胞樣或上皮細(xì)胞樣等。

細(xì)胞的貼附和伸展可分為幾個(gè)階段，以成纖維細(xì)胞為例，一般在接種細(xì)胞后5～10 min便可見細(xì)胞以偽足附著，與底物形成一些接觸點(diǎn)；接著細(xì)胞逐漸呈放射狀伸展開，細(xì)胞體的中心部分也隨之變扁平；最后細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞的貼附和伸展如圖1-8所示。圖1-9所示為掃描電鏡下大鼠成纖維細(xì)胞的貼附伸展過程。

圖1-8　細(xì)胞的貼附和伸展

圖1-9　掃描電鏡下大鼠成纖維細(xì)胞的貼附和伸展過程

（a）30min，吸附；（b）60min，接觸；（c）2h，貼壁；（d）24h，擴(kuò)展

細(xì)胞附著于底物是一種不需要能量的過程，一般認(rèn)為與電荷有關(guān)。一些特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如基膜素、纖維連接素、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞膜表面或培養(yǎng)液血清之中。在培養(yǎng)過程中，這些帶正電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促貼附因子的底物附著，隨后細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。一般來說，從底物脫離下來的貼附生長型細(xì)胞不能長時(shí)期在懸浮狀態(tài)下生長，除非這是一些轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞。

細(xì)胞的貼附和伸展，首先需要底物具備一定的條件（如上述的促貼附因子等），此外還受一些其他因素的影響。例如：

（1）離子的作用，如細(xì)胞的伸展需要有鈣離子的存在，鈣濃度低的培養(yǎng)液不利于細(xì)胞的伸展；

（2）機(jī)械、物理因素也可影響細(xì)胞的附著，如低溫或培養(yǎng)液的流動(dòng)過快均可妨礙細(xì)胞的附著。

有些生物因素對細(xì)胞的伸展可能有影響，如表皮生長因子可刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的皺褶樣活動(dòng)，成纖維細(xì)胞生長因子能減少3T3細(xì)胞在底物上的扁平程度。

2.接觸抑制

接觸抑制（contact inhibition）是體外培養(yǎng)中某些貼附生長型細(xì)胞的生長特性之一，是指當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞圍繞以致無處可去而發(fā)生接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)，接觸區(qū)域的細(xì)胞膜皺褶樣運(yùn)動(dòng)停止的現(xiàn)象。在培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量適宜的情況下，細(xì)胞膜會(huì)出現(xiàn)特征性的皺褶樣活動(dòng)，細(xì)胞快速生長增殖。隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片，發(fā)生接觸抑制。接觸抑制保證了正常細(xì)胞在培養(yǎng)中不會(huì)發(fā)生重疊，而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常細(xì)胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制而能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠維持生命活動(dòng)。

3.密度抑制

培養(yǎng)器皿中細(xì)胞過少或過密都會(huì)影響細(xì)胞的生長、增殖。當(dāng)細(xì)胞貼附生長、匯合成單層時(shí)，細(xì)胞變得較為擁擠，而扁平的程度減少，與培養(yǎng)液的接觸面減小，同時(shí)，培養(yǎng)液中的一些營養(yǎng)物逐漸被消耗掉，一些代謝產(chǎn)物的增加使pH值改變，此時(shí)單層細(xì)胞的分裂活動(dòng)停止，這種細(xì)胞可在靜止?fàn)顟B(tài)下存活一段時(shí)間，但不發(fā)生分裂增殖，這種生長特性稱為密度抑制（density inhibition）。由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，因此可以生長至很高的細(xì)胞密度。

三、體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程

（一）單個(gè)細(xì)胞的生長過程：細(xì)胞周期

細(xì)胞周期（cell cycle）是為研究細(xì)胞的生長行為而提出來的。細(xì)胞生長包括DNA合成及細(xì)胞分裂兩個(gè)關(guān)鍵過程。細(xì)胞周期即一個(gè)母細(xì)胞分裂結(jié)束后形成新細(xì)胞至下一次分裂結(jié)束形成兩個(gè)子細(xì)胞的時(shí)期，可分為間期和M期（分裂期）兩個(gè)階段。細(xì)胞群中多數(shù)細(xì)胞處于間期，少數(shù)細(xì)胞處于M期。一般間期較長，占細(xì)胞周期的90%～95%；M期較短，占細(xì)胞周期的5%～10%。細(xì)胞種類不同，一個(gè)細(xì)胞周期的時(shí)間也不相同。

在間期，細(xì)胞完成生長過程，主要為DNA的合成，即遺傳物質(zhì)DNA的復(fù)制。在間期中，DNA合成僅占其中的一段時(shí)間，稱為DNA合成期（S期）；在S期之前和S期之后，分別有兩個(gè)間隙階段，稱為DNA合成前期（G₁期）及DNA合成后期（G₂期）。因此，可將細(xì)胞周期歸納如下：

間期＝G₁期＋S期＋G₂期

細(xì)胞周期＝間期＋M期＝G₁期＋S期＋G₂期＋M期

M期為有絲分裂期，是細(xì)胞周期的終結(jié)期，此時(shí)每個(gè)細(xì)胞將分裂成2個(gè)子細(xì)胞。在M期，細(xì)胞所完成的主要是分裂，即遺傳物質(zhì)的分配。細(xì)胞處于分裂時(shí)稱為分裂相。細(xì)胞分裂相的多少可作為判斷細(xì)胞生長狀態(tài)和增殖旺盛情況的重要參考指標(biāo)。M期很短，也較穩(wěn)定，一般只有1～2h。細(xì)胞分裂的進(jìn)程又分為前、中、后、末4期。

細(xì)胞周期見表1-3及圖1-10。

表1-3　細(xì)胞周期

續(xù)表

圖1-10　細(xì)胞周期

（二）細(xì)胞系的生長過程

1.概述

取自動(dòng)物并置于體外培養(yǎng)中生長的細(xì)胞在其傳代之前稱為原代培養(yǎng)或原代細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長繁殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的細(xì)胞密度之后，就應(yīng)將細(xì)胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，此即傳代（passage）或再培養(yǎng)（subculture）。傳代生長以后，便成為細(xì)胞系（cell line）。一般正常細(xì)胞的這種細(xì)胞系的壽命只能維持一定的時(shí)間期限，稱為有限生長細(xì)胞系（limited growth line）。

因此，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命的期限并非無限的。當(dāng)細(xì)胞自動(dòng)物體內(nèi)取出后，在培養(yǎng)中大多數(shù)的細(xì)胞僅在有限的時(shí)間內(nèi)持續(xù)生長，然后將自行停止生長。即使提供這種細(xì)胞生長所需的包括血清在內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞最終仍會(huì)死亡。細(xì)胞系在培養(yǎng)中能夠存活時(shí)間的長短主要取決于細(xì)胞來自于何種動(dòng)物。例如，人胚成纖維細(xì)胞約可培養(yǎng)50代；恒河猴的皮膚成纖維細(xì)胞能傳代超過40代；雞胚胎成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)中則最多只有少數(shù)克隆能群體倍增30多次；小鼠成纖維細(xì)胞的壽命最短，正常者多數(shù)生長8代左右。

在體外培養(yǎng)時(shí)，不同組織來源以及不同年齡的人成纖維細(xì)胞的平均壽命也是不同的。例如，從年老的個(gè)體取得的成纖維細(xì)胞的壽命比取自年輕者的短。此外，可能影響培養(yǎng)細(xì)胞壽命的因素還有培養(yǎng)的條件等，如在上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入表皮生長因子，則可使之延緩衰老，壽命可從50代延長到150代。雖然體外培養(yǎng)的細(xì)胞最終會(huì)死亡，但還是可以生長一段時(shí)間。例如，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，若從10⁶個(gè)細(xì)胞開始，理論上成倍生長50次即可產(chǎn)生10⁶×2⁵⁰個(gè)細(xì)胞。因此，若小心地按一定的操作要求維持其生長，一個(gè)培養(yǎng)物有可能用于研究一段相當(dāng)長的時(shí)間。

2.體外培養(yǎng)細(xì)胞的壽命過程

體外培養(yǎng)細(xì)胞的壽命過程一般分為以下三個(gè)階段。圖1-11所示為體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)過程。

圖1-11　體外培養(yǎng)細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)過程

（1）原代培養(yǎng)或初代培養(yǎng)期：指新鮮組織自體內(nèi)取出并在體外培養(yǎng)生長至第一次傳代的時(shí)期，一般為1～4周。原代培養(yǎng)通常為異質(zhì)性，含較少的生長組分，為二倍體核型。此期中的細(xì)胞移動(dòng)比較活躍，有細(xì)胞分裂但并不旺盛。原代培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)相應(yīng)的細(xì)胞性狀相似，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性。因此，原代細(xì)胞是良好的實(shí)驗(yàn)對象，如用于藥物實(shí)驗(yàn)等。但需要注意的是此期生長細(xì)胞包含的類型較多。

（2）傳代期：原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長一定時(shí)間后，即融合成片而逐漸鋪滿底物的表面。此時(shí)，便應(yīng)將原代細(xì)胞分開接種至2個(gè)或更多個(gè)新的培養(yǎng)器皿中，即傳代。傳代大約數(shù)天至一周即可重復(fù)一次，持續(xù)數(shù)月，即為細(xì)胞系，一般是有限細(xì)胞系。傳代期的細(xì)胞增殖旺盛，一般仍然是二倍體核型，并保留原組織細(xì)胞的很多特征。但當(dāng)繼續(xù)長期反復(fù)傳代，細(xì)胞將逐漸失去其二倍體性質(zhì)，至一定期限后（一般為傳代30～50次后）細(xì)胞增殖變慢以至于停止分裂，于是進(jìn)入衰退期。

（3）衰退期：一般有限細(xì)胞系在此期開始時(shí)雖仍然存活，但增殖已很緩慢并逐漸完全停止，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡，此即體外培養(yǎng)細(xì)胞的“危機(jī)期（crisis）”。有限細(xì)胞系在生長過程中若不能通過“危機(jī)期”，將進(jìn)入衰退期而趨于死亡。但是，并非所有原代培養(yǎng)的傳代細(xì)胞最后全部發(fā)生死亡，傳代中偶爾可有極少的后代細(xì)胞能通過“危機(jī)期”，獲得不死性而具有持久或無限增殖的能力。這種細(xì)胞稱為無限細(xì)胞系或連續(xù)生長細(xì)胞系（infinite cell line）。培養(yǎng)細(xì)胞是否可以獲得無限繁殖生長的能力，與其種族、來源及性質(zhì)有關(guān)。例如，雞細(xì)胞在數(shù)次成倍生長后即死亡，即使是雞的腫瘤細(xì)胞也不能成為連續(xù)生長細(xì)胞系；人的腫瘤細(xì)胞有可能無限地生長；嚙齒類動(dòng)物的胚胎期細(xì)胞較易形成不死性的連續(xù)生長細(xì)胞系。至今，國際及國內(nèi)已建立了許多細(xì)胞系，其中大多數(shù)來自腫瘤。

3.細(xì)胞的生長過程

如上所述，置于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，如條件合適，將生長繁殖。在培養(yǎng)器皿中，細(xì)胞繁殖到一定程度后，供培養(yǎng)生長的區(qū)域被細(xì)胞占滿，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)被耗盡，如不及時(shí)傳代，原代細(xì)胞最終死亡。有限細(xì)胞系經(jīng)過一定的代數(shù)之后，最終衰退而死亡；連續(xù)生長細(xì)胞系則因具不死性而可永久地傳代、生長。細(xì)胞自接種至新培養(yǎng)瓶中，至其下一次再傳代接種的時(shí)間為細(xì)胞的一代（generation）。每代細(xì)胞的生長過程可分為三個(gè)階段：細(xì)胞先進(jìn)入生長緩慢的滯留階段，然后為增殖迅速的對數(shù)生長期，最后到達(dá)生長停止的平臺期。每一代細(xì)胞的生長過程如圖1-12所示。

圖1-12　每一代細(xì)胞的生長過程

（1）滯留期：包括懸浮期（游離期）及潛伏期。當(dāng)細(xì)胞接種入新的培養(yǎng)器皿，不論是何種細(xì)胞類型，其原來的形態(tài)如何，此時(shí)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體均呈圓球形。這些細(xì)胞先懸浮于培養(yǎng)液中，短時(shí)間后，那些尚可能存活的細(xì)胞即開始附著于底物，并逐漸伸展，恢復(fù)其原來的形態(tài)。再經(jīng)過潛伏期，此時(shí)細(xì)胞已存活，具有代謝及運(yùn)動(dòng)活動(dòng)但尚無增殖發(fā)生。然后出現(xiàn)細(xì)胞分裂并逐漸增多而進(jìn)入對數(shù)生長期。一般細(xì)胞滯留期不長，為24～96h。腫瘤細(xì)胞及連續(xù)生長細(xì)胞系則更短，可少于24h。

（2）對數(shù)生長期：又稱指數(shù)生長期。此期細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞生長增殖狀況可以細(xì)胞倍增情況（細(xì)胞群體倍增時(shí)間）及細(xì)胞分裂指數(shù)等來判斷。在此階段，若細(xì)胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長繁殖，細(xì)胞數(shù)量日漸增加。細(xì)胞將接觸連成一片，逐漸鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細(xì)胞生長的區(qū)域逐漸減少甚至消失，因接觸抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止，因密度抑制細(xì)胞終止分裂，細(xì)胞不再繁殖而進(jìn)入平臺期。此期的長短因細(xì)胞本身特性及培養(yǎng)條件而不完全相同，一般可持續(xù)3～5d。

（3）平臺期：又稱生長停止期。此期可供細(xì)胞生長的底物面積已被生長的細(xì)胞所占滿，細(xì)胞雖尚有活力但已不再分裂增殖。此時(shí)細(xì)胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動(dòng)并可繼續(xù)存活一定的時(shí)間。若及時(shí)分離培養(yǎng)、進(jìn)行傳代，將細(xì)胞分開接種至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞將于新的培養(yǎng)器皿中成為下一代的細(xì)胞而再次繁殖。否則，若傳代不及時(shí)，細(xì)胞將因中毒而發(fā)生改變，甚至脫落、死亡。

每次傳代接種后，若在細(xì)胞的生長繁殖過程中進(jìn)行檢測計(jì)數(shù)，可以繪制成曲線，稱為生長曲線。細(xì)胞的生長曲線各具特點(diǎn)，是該細(xì)胞生物學(xué)特性指標(biāo)之一。

四、影響動(dòng)物細(xì)胞體外生長的因素

體外培養(yǎng)的細(xì)胞脫離了在體內(nèi)時(shí)的調(diào)節(jié)和控制，獨(dú)立面對生長環(huán)境中的各種因素，只有適應(yīng)體外環(huán)境條件才能生長。除了向培養(yǎng)基（液）中釋放代謝產(chǎn)物或者分泌一些生物活性物質(zhì)而影響培養(yǎng)基（液）之外，幾乎對生長環(huán)境產(chǎn)生不了較大的主動(dòng)影響。但是，如果環(huán)境因素發(fā)生改變，將會(huì)對細(xì)胞生長帶來明顯的影響。

（一）營養(yǎng)成分與生長基質(zhì)

營養(yǎng)條件是細(xì)胞體外生長的基本條件，體外培養(yǎng)細(xì)胞的營養(yǎng)條件主要是通過培養(yǎng)液來提供的。在培養(yǎng)液中，除了細(xì)胞生命活動(dòng)所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)之外，還必須具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與功能活動(dòng)的激素、生長因子以及生長基質(zhì)成分等。盡管已開發(fā)的各種人工合成培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且明確，但始終缺乏某些尚不清楚的與細(xì)胞生長發(fā)育和功能活動(dòng)有關(guān)的微量成分。培養(yǎng)液中一般仍需要加入5%～20%的血清。建立完全滿足細(xì)胞體外生長要求的無血清培養(yǎng)基是目前研究的熱點(diǎn)。

（二）溫度

溫度能夠影響體內(nèi)細(xì)胞的代謝活動(dòng)。在生理溫度范圍內(nèi)，溫度越高，酶活性越高，細(xì)胞代謝越快，這種相關(guān)性同樣適用于體外的情況。

大多數(shù)動(dòng)物的生命活動(dòng)在10～45℃的外界溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。然而，每種動(dòng)物有其最適宜的溫度，例如，雞的適宜溫度是38℃，在36～39℃也可以生長，雞胚組織甚至在26～44℃范圍內(nèi)都可以生長，但生長的速度會(huì)受到一定的影響。HeLa細(xì)胞最適宜的溫度是38℃，在24～40℃范圍內(nèi)仍能生長。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在25～35℃范圍內(nèi)仍然能夠生存和生長。若將培養(yǎng)細(xì)胞放在4℃下，數(shù)小時(shí)后再放回37℃，細(xì)胞仍然能夠繼續(xù)生長。

體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞最常用的溫度是37℃。培養(yǎng)的細(xì)胞對較低溫度的耐受能力比對較高溫度（一般不超過39℃）的耐受能力強(qiáng)。高于生理溫度閾值時(shí)，溫度越高，對細(xì)胞損傷越大。培養(yǎng)的細(xì)胞處在39～40℃下1h，即會(huì)受到一定的損傷，但仍然可以恢復(fù)；在41～42℃下1h，細(xì)胞便會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p傷，絕大多數(shù)細(xì)胞將死亡；當(dāng)培養(yǎng)溫度高達(dá)43℃時(shí)，1h內(nèi)細(xì)胞將全部死亡。

在生理溫度范圍內(nèi)，溫度越低，酶活性越低。當(dāng)溫度降至細(xì)胞所能忍受的最低限度時(shí)，細(xì)胞的生命活動(dòng)即會(huì)受到抑制。如果將雞胚細(xì)胞在0.5℃環(huán)境下冷處理4h，恢復(fù)至正常溫度時(shí)仍可以很好地生長，只不過要有一定的恢復(fù)期。不同細(xì)胞能夠忍受的低溫閾值不同，能夠忍受低溫環(huán)境的時(shí)間長短也不同。低溫條件能造成一定的細(xì)胞死亡。例如，人的淋巴細(xì)胞對低溫比較敏感，當(dāng)在3℃培養(yǎng)時(shí)，死亡率可達(dá)30%；當(dāng)在19℃培養(yǎng)時(shí)，死亡率為20%；當(dāng)在36～39℃培養(yǎng)時(shí)，死亡率僅為1.6%；當(dāng)在40℃培養(yǎng)時(shí)，死亡率又升至4.6%。當(dāng)將細(xì)胞暴露在冰點(diǎn)溫度時(shí)，細(xì)胞外環(huán)境中的水結(jié)冰，細(xì)胞外溶液的滲透壓增高，細(xì)胞內(nèi)的水向外移動(dòng)，細(xì)胞發(fā)生縮水，結(jié)果使得細(xì)胞漿濃度增大，引起細(xì)胞死亡。同時(shí)，細(xì)胞的代謝受到抑制。冰晶的形成也會(huì)對細(xì)胞造成一定的傷害。

（三）氣相環(huán)境

培養(yǎng)細(xì)胞的氣相環(huán)境尤其是O₂和CO₂對細(xì)胞生長也有影響。O₂參與細(xì)胞的能量代謝過程，而CO₂對維持培養(yǎng)液的酸堿度很重要。體外培養(yǎng)的氣相條件主要取決于培養(yǎng)物的類型、培養(yǎng)液的類型、培養(yǎng)系統(tǒng)（開放式或密閉式系統(tǒng)）以及需要的緩沖能力等因素。細(xì)胞培養(yǎng)與器官培養(yǎng)的氣相環(huán)境差別較大。

對于絕大多數(shù)開放式培養(yǎng)系統(tǒng)來講，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的氣相環(huán)境都是采用5%CO₂與95%空氣的混合氣體。個(gè)別類型細(xì)胞生長需要有別于此的氣相條件。

除少數(shù)可以糖酵解途徑獲得能量的動(dòng)物細(xì)胞及微生物之外，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞在缺氧條件下不能生存。對于封閉式培養(yǎng)的單層細(xì)胞，氧分壓的適宜范圍為1995～9975Pa。培養(yǎng)液中的溶解氧濃度一般為7.6μg／mL。因此，無論是開放式培養(yǎng)還是密閉式培養(yǎng)，不論是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)還是大規(guī)模培養(yǎng)，給培養(yǎng)物提供足夠的O₂是必需的。然而，氣相環(huán)境中O₂含量超過大氣中的O₂含量時(shí)，對培養(yǎng)細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生毒害作用。

（四）培養(yǎng)液的酸堿度

大多數(shù)細(xì)胞能在pH6.0～8.0的環(huán)境中生存，最適宜的pH值范圍是7.2～7.4。人類血液的pH值一般恒定在7.4左右。當(dāng)人類血液的pH值降至7.0時(shí)，可引起酸中毒，導(dǎo)致昏迷甚至死亡；當(dāng)pH值升至7.8時(shí)，能引起手足抽搐甚至死亡。培養(yǎng)的細(xì)胞若處于過酸或過堿的環(huán)境中，同樣會(huì)發(fā)生酸中毒或堿中毒。

體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞耐酸能力要強(qiáng)于耐堿能力。發(fā)生惡變的細(xì)胞常常比正常細(xì)胞能忍受更廣的pH值范圍。繼代培養(yǎng)的細(xì)胞忍受酸堿度變化的能力略強(qiáng)于原代培養(yǎng)的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸對細(xì)胞的損害比無機(jī)酸要大，一般的順序是：硫酸或鹽酸＜磷酸＜檸檬酸＜乳酸＜醋酸。

酸堿度可以影響各種弱酸進(jìn)出細(xì)胞。在酸性環(huán)境中生長時(shí)，H＋可使H2CO₃以分子的形式進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分解而使得細(xì)胞內(nèi)酸化。相反，當(dāng)在堿性環(huán)境中生長時(shí)，H2CO₃可以從細(xì)胞內(nèi)出來，與培養(yǎng)液中的堿結(jié)合，形成重碳酸鹽。

CO₂是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，直接釋放到培養(yǎng)液之中，積累較多時(shí)會(huì)引起培養(yǎng)液變酸。一般需在培養(yǎng)液中加入緩沖劑以維持pH值在適宜范圍。

（五）輻射

動(dòng)物細(xì)胞一般在持續(xù)黑暗的條件下培養(yǎng)。能夠?qū)w外培養(yǎng)的細(xì)胞生長產(chǎn)生影響的射線包括可見光、紫外線、X射線、β射線以及γ射線等。

1.可見光

由于動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)是生長在黑暗環(huán)境中，故培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞一般也是在黑暗條件下進(jìn)行。如果給培養(yǎng)的細(xì)胞提供光照條件，將會(huì)對細(xì)胞的生長產(chǎn)生一定的影響。多數(shù)有關(guān)光照與動(dòng)物細(xì)胞生長關(guān)系的研究結(jié)果表明，光線能夠促使培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生退化。此外，不同波長的光線對細(xì)胞生長的作用有所不同，不同細(xì)胞對于光線照射的反應(yīng)有差異。

2.紫外線

紫外線在細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用主要是滅菌或消毒。紫外線能夠影響細(xì)胞的生命活動(dòng)，對細(xì)胞生長造成破壞。不同波長的紫外線對細(xì)胞造成的傷害程度不同，波長越短的紫外線損傷越嚴(yán)重。不同細(xì)胞對紫外線的敏感性是不同的。例如，HeLa細(xì)胞相對于成年人的成纖維細(xì)胞，對紫外線的反應(yīng)更敏感，而胚胎成纖維細(xì)胞又比成年人的成纖維細(xì)胞對紫外線更敏感。紫外線對細(xì)胞生長的影響主要在于能破壞細(xì)胞的遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

3.X射線、β射線與γ射線

不同類型的細(xì)胞對X射線、β射線與γ射線的反應(yīng)不同，反應(yīng)也因射線劑量與細(xì)胞生長條件不同而有所不同。低劑量時(shí)將緩慢降低細(xì)胞的增生率，高劑量時(shí)將對培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生致死效應(yīng)。X射線照射后，盡管細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與代謝活動(dòng)仍可進(jìn)行，生長仍在繼續(xù)，但分裂活動(dòng)受到抑制。例如，HeLa細(xì)胞在受到10Gy劑量X射線照射后，部分細(xì)胞可發(fā)展成為巨細(xì)胞，細(xì)胞體積會(huì)比正常HeLa細(xì)胞的體積大許多倍。隨著照射劑量的加大，HeLa細(xì)胞迅速退化。1000Gy的高劑量可引起全部細(xì)胞即刻停止活動(dòng)而死亡?，F(xiàn)已明確，X射線照射能夠引起染色體發(fā)生畸變。

β射線與γ射線對培養(yǎng)細(xì)胞造成的影響與X射線相似，主要也是通過引起染色體發(fā)生畸變而致細(xì)胞分裂活動(dòng)發(fā)生異?；蚴艿揭种?。若超過一定劑量，會(huì)引起細(xì)胞死亡。

射線對細(xì)胞生命活動(dòng)的影響也有有益的應(yīng)用。例如，體外培養(yǎng)某些難以存活的細(xì)胞或者某些有特殊需要的細(xì)胞（如胚胎干細(xì)胞、單細(xì)胞克隆等）時(shí)，經(jīng)常將這些細(xì)胞接種在一些能分泌促分裂增殖活性因子、促生長活性物質(zhì)或干細(xì)胞因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，為了防止飼養(yǎng)層細(xì)胞增殖，一般先以一定劑量射線照射飼養(yǎng)層細(xì)胞，這樣既能在一定時(shí)間內(nèi)保持飼養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生促生長活性物質(zhì)的能力，又能抑制飼養(yǎng)層細(xì)胞的分裂增殖活動(dòng)。

（六）超聲波

超聲波對培養(yǎng)的細(xì)胞一般會(huì)產(chǎn)生破壞作用，強(qiáng)度稍大時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞破裂。超聲波主要是通過空化作用而引起細(xì)胞死亡的。另外，超聲的機(jī)械作用、熱學(xué)作用以及化學(xué)作用等都能對細(xì)胞產(chǎn)生很大影響。不同的細(xì)胞對超聲波的敏感性不同。衰老的細(xì)胞對超聲波的破壞作用特別敏感。成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞對超聲波都很敏感，而上皮細(xì)胞對超聲波有較強(qiáng)的抵抗力。

（七）影響細(xì)胞生長的其他因素

1.橡膠的毒性作用

橡膠制品（如膠塞、橡皮墊、吸管帽和各種橡皮管等）是體外培養(yǎng)工作中常用的物品，而普通的橡膠對細(xì)胞都有毒。有人曾將普通膠塞浸于合成培養(yǎng)液中1周，然后用這種培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這種培養(yǎng)液能在48h內(nèi)造成培養(yǎng)細(xì)胞死亡。許多實(shí)驗(yàn)室為了去除新膠塞上的污垢，常常用熱堿與熱酸煮沸處理，事實(shí)上并不能明顯降低其毒性作用。如果用乙醚或者乙醚、丙酮和乙醇聯(lián)合處理，能夠較好地降低橡膠制品的毒性作用。一般來說，純橡膠與硅膠的毒性較弱，黑橡膠的毒性較強(qiáng)。

2.離心處理

離心處理是培養(yǎng)過程中不可缺少的環(huán)節(jié)。在用消化酶作用后，為了去除細(xì)胞懸液中的含酶溶液，需要通過離心除去上清液；在原代培養(yǎng)前分離目的細(xì)胞，需要使用密度梯度離心法處理。離心力對細(xì)胞是有影響的。離心力越大，對細(xì)胞造成的傷害越大。普通離心比密度梯度離心所造成的傷害要大。普通離心一般使用低于1000r／min的轉(zhuǎn)速，離心時(shí)間常為5～10min。如果離心的目的只是排除細(xì)胞懸液中的含酶溶液，盡量不要采用過高的速度和過長的時(shí)間，應(yīng)盡可能減少離心的次數(shù)，只要能將細(xì)胞沉淀下來即可。離心處理對生命力脆弱的細(xì)胞（如神經(jīng)元）的傷害要比生命力旺盛的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）大。

3.培養(yǎng)液的沖擊力

由于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼附生長型細(xì)胞，如果受到培養(yǎng)液的沖擊而致細(xì)胞脫壁，必將對細(xì)胞生長造成影響，這在用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法以及各種大規(guī)模培養(yǎng)方法時(shí)尤其要注意。培養(yǎng)液的過激流動(dòng)除了直接對細(xì)胞產(chǎn)生沖擊力之外，液體流動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的氣泡對培養(yǎng)細(xì)胞的影響更為突出。

4.培養(yǎng)液的滲透壓

盡管大多數(shù)操作者都知道細(xì)胞必須生長在等滲溶液中，但在具體培養(yǎng)過程中往往不注意或者不容易控制培養(yǎng)液的滲透壓，尤其在往合成培養(yǎng)基中添加其他成分時(shí)會(huì)忽視培養(yǎng)液的滲透壓問題。人血漿的滲透壓約為290mOsm／kg，此值可作為培養(yǎng)液滲透壓的理想?yún)⒖贾?。大多?shù)細(xì)胞的適宜滲透壓范圍為260～320mOsm／kg，但不同細(xì)胞的適宜滲透壓值可能有差異，須視具體情況進(jìn)行調(diào)整。

知識拓展

Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞）是從非洲綠猴的腎臟上皮細(xì)胞中分離培養(yǎng)出來的，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的一個(gè)細(xì)胞系。這個(gè)細(xì)胞系由日本千葉大學(xué)的Yasumura和Kawakita于1962年擴(kuò)增出來。該細(xì)胞系取“Verda Reno”（世界語，意為“綠色的腎臟”）的簡寫而命名為“Vero”，而“Vero”本身在世界語中也有“真相”的意思。該細(xì)胞易于培養(yǎng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)。這種細(xì)胞作為人用疫苗的細(xì)胞基質(zhì)是安全可靠的，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織推薦作為生產(chǎn)人用疫苗的理想細(xì)胞基質(zhì)。

3T3細(xì)胞是指G.J.Todaro等從Swiss系小鼠胎兒里得到的細(xì)胞株。由于它顯示出強(qiáng)烈的接觸抑制作用，所以能明確地識別已發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并可作為一種重要的細(xì)胞材料應(yīng)用于由腫瘤病毒和致癌劑等所引起的體外致癌研究。這一細(xì)胞系是將3×10⁵細(xì)胞接種在底部直徑為5cm的培養(yǎng)皿上，根據(jù)每三天進(jìn)行一次連續(xù)培養(yǎng)的方法而建立的，“3T3”這一名稱便由此而得。同樣，由6×10⁵細(xì)胞或12×10⁵細(xì)胞進(jìn)行接種而得的細(xì)胞株分別稱為3T6和3T12，這些細(xì)胞的接觸抑制作用很弱。此外，在與3T3同一類的細(xì)胞中，有來自Balb／C系小鼠的Balb 3T3細(xì)胞。

電離輻射傳遞給每單位質(zhì)量的被照射物質(zhì)的平均能量，稱為吸收劑量。吸收劑量的國際單位是戈瑞（Gy），專用單位是拉德（rad），兩者的換算關(guān)系是1Gy＝1J／kg＝100rad，1rad＝10^-2 Gy＝100erg／g。單位時(shí)間內(nèi)的吸收劑量稱為吸收劑量率，其單位是戈瑞／小時(shí)（Gy／h）。

思考題

1.什么是貼附生長型細(xì)胞和懸浮生長型細(xì)胞？

2.上皮型細(xì)胞的起源及主要形態(tài)學(xué)特征是什么？

3.什么是細(xì)胞的接觸抑制？

4.成纖維型細(xì)胞的起源及主要形態(tài)學(xué)特征是什么？

5.簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長類型。

6.簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程。

7.影響細(xì)胞黏附和貼壁的因素是什么？

8.簡述傳代培養(yǎng)期的概念及特點(diǎn)。