動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)_動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)1　動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)是指通過(guò)組織塊直接長(zhǎng)出的單層細(xì)胞，或用化學(xué)和物理方法將組織分散成單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)，在首次傳代前的培養(yǎng)皆可認(rèn)為是原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)最大的優(yōu)點(diǎn)是，組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。特別是在細(xì)胞培養(yǎng)匯合時(shí)，原代培養(yǎng)的某些特殊功能表達(dá)尤為強(qiáng)烈，在這樣的培養(yǎng)階段能更好地顯示與親體組織緊密結(jié)合的形態(tài)學(xué)特征。在供體來(lái)源充分、生物學(xué)條件穩(wěn)定的情況下，采用原代培養(yǎng)做各種實(shí)驗(yàn)，如藥物測(cè)試、細(xì)胞分化等，效果尤佳。但應(yīng)注意，原代培養(yǎng)組織是由多種細(xì)胞成分組成的，比較復(fù)雜。即使全為同一類(lèi)型的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，也仍具有異質(zhì)性，在分析細(xì)胞生物學(xué)特性時(shí)比較困難。其次，由于供體的個(gè)體差異及其他一些原因，細(xì)胞群生長(zhǎng)效果有時(shí)也不一致。

一、培養(yǎng)細(xì)胞的取材與分離

（一）培養(yǎng)細(xì)胞的取材

動(dòng)物體內(nèi)絕大部分組織細(xì)胞都可以在體外培養(yǎng)，但培養(yǎng)的難易程度與組織類(lèi)型、分化程度、供體的年齡、原代培養(yǎng)方法等直接相關(guān)。原代取材是進(jìn)行組織細(xì)胞培養(yǎng)的第一步，若取材不當(dāng)，將會(huì)直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

1.取材的基本要求

（1）所取組織最好盡快培養(yǎng)。

取材時(shí)應(yīng)盡量在4～6h內(nèi)制成細(xì)胞，盡快入箱培養(yǎng)。因故不能即時(shí)培養(yǎng)的，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4℃冰箱中。如果組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm³以下的小塊于培養(yǎng)基內(nèi)4℃存放，但時(shí)間不能超過(guò)24h。

（2）取材應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌。

取材應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。使用無(wú)菌包裝的器皿或用事先消毒好的、帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400U／mL抗生素）的小瓶等便于攜帶的物品取材。所取材料要盡量避免紫外線照射和接觸化學(xué)試劑（如碘、汞、酒精等）。從消化道、周?chē)袎乃澜M織等疑有污染因素存在的區(qū)域取材時(shí)，為減少污染，可用500～1000U／mL的青鏈霉素平衡鹽溶液漂洗5～10 min再做培養(yǎng)，以確保所取材料無(wú)菌。

（3）防止機(jī)械損傷。

在取材和原代培養(yǎng)時(shí)，要用鋒利的器械（如手術(shù)刀片或剃須刀片）切碎組織，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。

（4）去除無(wú)用組織和避免干燥。

對(duì)于組織樣本帶有的血液（血塊）、脂肪、神經(jīng)組織、結(jié)締組織和壞死組織，取材時(shí)要細(xì)心除去。為避免組織干燥，修剪和切碎過(guò)程可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。

（5）營(yíng)養(yǎng)要豐富。

原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液，最好添加胎牛血清，含量以10%～20%為宜。

（6）培養(yǎng)組織的正確選擇。

取材時(shí)應(yīng)注意組織類(lèi)型、分化程度、年齡等因素。要采用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，低分化的組織較高分化的組織容易生長(zhǎng)，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。

（7）注意保存原代組織的相關(guān)材料及信息。

為了便于以后鑒別原代組織的來(lái)源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)后與原組織的差異，原代取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對(duì)組織的來(lái)源、部位，以及供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄，以備以后查詢。

2.取材的基本器材和用品

（1）眼科組織彎剪、彎鑷、手術(shù)刀（用前消毒）。

（2）裝有無(wú)血清培養(yǎng)基或Hank′s液的小瓶。

（3）燒杯或錐形瓶（10mL、50mL）。

（4）培養(yǎng)皿。

3.各類(lèi)組織的取材方法

（1）皮膚和黏膜的取材。

皮膚和黏膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來(lái)源，也可以獲得成纖維細(xì)胞。皮膚和黏膜主要取自手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)的操作，但面積一般為2～3mm²即可。這樣局部不留瘢痕。取材時(shí)不要用碘酒消毒。

皮膚和黏膜培養(yǎng)多是以獲取上皮細(xì)胞為目的，因而無(wú)論何種方法取材都不要切取太厚，并要盡可能去除所攜帶的皮下或黏膜下組織。如欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞則反之。皮膚、黏膜分布在機(jī)體外部或與外界相通的部位，表面細(xì)菌、霉菌很多，取材時(shí)要嚴(yán)格消毒，必要時(shí)用較高濃度的抗菌素溶液漂洗、浸泡。

（2）內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材。

內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的，內(nèi)臟和實(shí)體瘤取材時(shí)，一定要明確和熟悉自己所需組織的類(lèi)型和部位，要去除不需要的部分如血管、神經(jīng)和組織間的結(jié)締組織；實(shí)體瘤取材時(shí)要盡可能取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，避開(kāi)破潰、壞死、液化部分，以防污染。但有些復(fù)發(fā)性、浸潤(rùn)性較強(qiáng)的腫瘤，較難取到較為純凈的瘤體組織，其腫瘤組織與結(jié)締組織混雜在一起，培養(yǎng)后會(huì)有很多纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，給以后的培養(yǎng)工作帶來(lái)困難。

（3）血液細(xì)胞的取材。

血液中的白細(xì)胞是很常用的培養(yǎng)材料，常用于進(jìn)行染色體分析、淋巴細(xì)胞體外激活進(jìn)行免疫治療等。一般抽取靜脈外周血，微量時(shí)也可從指尖或耳垂取血。取材時(shí)應(yīng)注意抗凝，通常采用肝素抗凝劑，常用肝素濃度為8～20U／mL，抽血前針管也要用濃度較高的肝素（500U／mL）潤(rùn)濕?？鼓齽┑牧恳援a(chǎn)生抗凝效果的最小量為宜，量過(guò)大時(shí)易導(dǎo)致溶血。抽血時(shí)要嚴(yán)格無(wú)菌。

（4）骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi)細(xì)胞的取材。

取此類(lèi)標(biāo)本時(shí)，除嚴(yán)格無(wú)菌，注意抗凝外，還要盡快分離培養(yǎng)。這幾種樣品取材后一般不需要其他處理，離心后用無(wú)Ca^2＋、Mg^2＋的PBS洗兩次，再用培養(yǎng)基洗一次即可培養(yǎng)，不宜低溫保存。

（5）動(dòng)物組織的取材。

①鼠胚組織的取材。

鼠胚組織易于培養(yǎng)，同時(shí)鼠與人類(lèi)相近，都是哺乳類(lèi)動(dòng)物，因此鼠胚組織已成為較常用的培養(yǎng)材料。由于小鼠的毛中隱藏的微生物較多，而且不易消毒，所以取材時(shí)更要注意無(wú)菌消毒，其無(wú)菌消毒一般采用以下方法進(jìn)行：首先用引頸或氣管窒息致死法殺死孕期合適的動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸入盛有75%酒精的燒杯中5min（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免酒精從口和其他孔道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力）。取出動(dòng)物后放在消毒后的小木板上，用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，然后用眼科剪和止血鉗剪開(kāi)皮膚，解剖取材。也可在酒精消毒后，沿動(dòng)物軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后固定，更換無(wú)菌剪解剖取材，采用無(wú)菌操作法解剖，取出胚胎。取好的組織要放置在另一干凈的培養(yǎng)皿中或玻璃板上進(jìn)行原代培養(yǎng)操作。動(dòng)物消毒后的操作宜在超凈工作臺(tái)內(nèi)或無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。鼠胚組織的取材如圖1-42所示。

②幼鼠胚肺（腎）的取材。

幼鼠處死消毒方法同上，腹部朝上固定在木板上，切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側(cè)。采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部皮毛切開(kāi)游離并拉向兩側(cè)，然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎。

③雞胚組織的取材。

雞胚是組織培養(yǎng)經(jīng)常利用的材料，一般使用雞胚時(shí)應(yīng)自行孵育。主要步驟如下：精選新鮮受精雞蛋，擦掉表面的臟物，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育，箱內(nèi)同時(shí)放一盛水的水盤(pán)以維持培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。取孵化至適當(dāng)胚齡（9～11d，在此期間，每天翻動(dòng)雞蛋一次）的胚蛋。用照蛋燈在暗處燈檢，如有豐富血管、胚體有運(yùn)動(dòng)，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，用有色筆畫(huà)出氣室和胚體位置。將胚蛋以氣室（大頭）向上置于蛋架上，用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干。經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，無(wú)菌條件下，用剪刀或中號(hào)鑷子打開(kāi)氣室，沿氣室邊緣環(huán)行剪除蛋殼，用眼科鑷撕去蛋膜，暴露出雞胚，用鈍彎頭玻璃棒伸入蛋中輕輕挑起雞胚，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，解剖取材。

圖1-42　鼠胚組織的取材

（a）斷髓處死；（b）酒精消毒；（c）環(huán)形剪開(kāi)皮膚；（d）外翻剝皮；（e）打開(kāi)腹腔；（f）取出雙子宮；（g）取胚胎

4.組織材料的分離

從動(dòng)物體內(nèi)取出的各種組織均有結(jié)合相當(dāng)緊密的多種細(xì)胞和纖維成分，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，即使采用1mm³的組織塊，也僅有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)。若要獲得大量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，須將組織塊充分分散開(kāi)，使細(xì)胞解離出來(lái)。另外，有些實(shí)驗(yàn)需要提取組織中的某些細(xì)胞，也須首先將組織解離，然后才能分離出細(xì)胞。目前常采用的方法有機(jī)械法和化學(xué)法兩種，可根據(jù)組織種類(lèi)和培養(yǎng)要求，選用適宜的方法。

（1）細(xì)胞懸液的分離方法。

對(duì)于血液、羊水、胸水和腹水等懸液材料時(shí)，可采用離心法分離。一般500～1000 r／min離心5～10min。如果懸液量大，時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，但速度不能太大，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，離心速度過(guò)大、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)擠壓細(xì)胞使其損傷甚至死亡。離心沉淀物用無(wú)Ca^2＋、Mg^2＋的PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。

（2）組織塊的分離方法。

對(duì)于組織塊材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法、剪切分散法和消化分離法。

①機(jī)械分散法。

在采用一些纖維成分很少的組織進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以直接用機(jī)械方法進(jìn)行分散，如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織等。

可采用剪刀剪切、用吸管反復(fù)吹打的方式分散組織細(xì)胞，或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用4～5號(hào)針）通過(guò)針頭壓出，或在不銹鋼篩網(wǎng)內(nèi)用鈍物（常用注射器鈍端）將細(xì)胞從網(wǎng)孔中擠壓出。但此方法對(duì)組織損傷較大，而且細(xì)胞分散效果差，通常適用于處理纖維成分少的軟組織，對(duì)硬組織和纖維性組織效果不好。

圖1-43　機(jī)械分散法

操作方法：將組織用Hank′s液或無(wú)血清培養(yǎng)液漂洗，然后將其剪成5～10mm³的小塊，置于80目的不銹鋼篩中；把篩網(wǎng)放在培養(yǎng)皿中，用注射器針芯輕輕擠壓組織，使之穿過(guò)篩網(wǎng)；用吸管從培養(yǎng)皿中吸出組織懸液，置于150目篩中用上述方法同樣處理；鏡檢，計(jì)數(shù)過(guò)濾的細(xì)胞懸液，然后接種培養(yǎng)。如組織過(guò)大，可用400目篩再過(guò)濾一次。機(jī)械分散法如圖1-43所示。

②剪切分散法。

在進(jìn)行組織塊移植培養(yǎng)時(shí)，可以采用剪切分散法，即將組織剪或切成1mm³左右的小塊，然后分離培養(yǎng)。

操作方法：首先將經(jīng)修整和沖洗過(guò)的組織塊（大小約為1cm³）放入小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪切組織至糊狀；用吸管吸取Hank′s液或無(wú)血清培養(yǎng)液加入燒杯中，輕輕吹打片刻；低速離心，去上清液，剩下的組織小塊即可用于培養(yǎng)。為避免剪刀對(duì)組織的擠壓損傷，也可以用手術(shù)刀或保險(xiǎn)刀片交替切割組織，但操作費(fèi)時(shí)，不易切割得很細(xì)。

③消化分離法。

消化分離法是把組織剪切成較小團(tuán)塊，利用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使組織松散、細(xì)胞分開(kāi)，以此獲得的細(xì)胞制成懸液后可直接進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)，成活率高。各種消化試劑的作用機(jī)制各不相同，要根據(jù)組織類(lèi)型和培養(yǎng)的具體要求選擇消化方法和試劑。

a.胰蛋白酶消化法。

胰蛋白酶是目前應(yīng)用最為廣泛的組織消化分離試劑，適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離胚胎、上皮、肝、腎等組織，對(duì)傳代培養(yǎng)細(xì)胞效果也較好。但對(duì)于纖維性組織和較硬的癌組織效果較差。若與膠原酶合用，就能增加對(duì)這些組織的分離作用。

胰蛋白酶的消化效果主要與胰蛋白酶的濃度、pH值、溫度、組織塊的大小和硬度有關(guān)。市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過(guò)測(cè)定，但使用時(shí)必須新鮮配制，保存在低溫冰箱中，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān)。

一般采用的胰蛋白酶濃度為0.1%～0.5%，最常用濃度為0.25%。濃度高時(shí)對(duì)細(xì)胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)基中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。Ca^2＋、Mg^2＋及血清均對(duì)胰蛋白酶活性有抑制作用。消化過(guò)程中使用的液體應(yīng)不含這些離子及血清；在消化傳代細(xì)胞后，可直接加含血清培養(yǎng)液將其滅活，而不必再用Hank′s液清洗。

8.0～9.0是胰蛋白酶活力適宜pH值范圍，隨著堿性的增加其活力也隨之減弱，一般使用pH　8.0，這樣消化后殘留的胰蛋白酶溶液不會(huì)對(duì)培養(yǎng)液的pH值帶來(lái)明顯的變化。

一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性最強(qiáng)，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能采用，以37℃為最佳，但在夏季，25℃以上對(duì)一般傳代細(xì)胞也能達(dá)到消化效果。4℃時(shí)胰蛋白酶仍有緩慢的消化作用。

消化時(shí)間要根據(jù)不同情況而定，溫度低、組織塊大、胰蛋白酶濃度低者，消化時(shí)間長(zhǎng)，反之則應(yīng)縮短消化時(shí)間。如果細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可損害細(xì)胞的呼吸酶，從而影響細(xì)胞的代謝，一般消化時(shí)間以20min為宜。一般新鮮配制的胰蛋白酶消化力很強(qiáng)，所以開(kāi)始使用時(shí)要注意觀察。另外，有些組織和細(xì)胞比較脆弱，對(duì)胰蛋白酶的耐受性差，因而要分次消化，并及時(shí)把已消化下來(lái)的細(xì)胞與組織分開(kāi)放入含有血清的培養(yǎng)液中，更換消化液后再繼續(xù)消化。

操作方法：將組織剪成1～2mm³的小塊，置于事先放置有磁性攪拌棒的三角燒瓶?jī)?nèi)，再注入3～5倍組織量的37℃的胰蛋白酶，放在磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，速度要慢一些，一般消化20～60min。也可以放入水浴或培養(yǎng)箱中，每隔5～10min搖動(dòng)一次。如需長(zhǎng)時(shí)間消化，可每隔15min取出2／3上清液，移入另一離心管，冰浴，或離心后去除胰蛋白酶，收集沉淀細(xì)胞，加入含血清培養(yǎng)液，然后給原三角燒瓶添加新的胰蛋白酶繼續(xù)消化。也可放入4℃冰箱中過(guò)夜進(jìn)行消化，消化完畢后將消化液和分次收集的細(xì)胞懸液通過(guò)100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，以除掉未充分消化的大塊組織。離心去除胰蛋白酶，用Hank′s液或培養(yǎng)液漂洗1～2次，每次800～1000r／min離心3～5min。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，一般按每毫升5×10⁵～1×10⁶個(gè)接種培養(yǎng)瓶。如果采用4℃下的冷消化，時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)12～24h。從冰箱取出離心后，可再添加胰蛋白酶，置于37℃培養(yǎng)箱中，繼續(xù)溫?zé)嵯?0～30min，效果可能更好。

b.膠原酶法。

膠原酶是從梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織及腫瘤組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。Ca^2＋、Mg^2＋和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用，因而可用平衡鹽溶液或含血清的培養(yǎng)液配制，這樣實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便并能提高細(xì)胞成活率。膠原酶的常用劑量為200U／mL或0.1～0.3mg／mL。此酶消化作用緩和，不需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。

膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專(zhuān)用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類(lèi)型選擇膠原酶類(lèi)型，如膠原酶Ⅳ型可消化胰腺，膠原酶Ⅱ型可用于消化肝、骨、甲狀腺、心臟、唾液腺等組織，膠原酶Ⅲ型對(duì)哺乳動(dòng)物的組織有廣泛的消化作用。

操作方法：將漂洗、修剪干凈的組織剪成1～2mm³的小塊；將組織塊放入三角燒瓶中，加入3～5倍體積的膠原酶，密封燒瓶；將燒瓶放入37℃水浴或37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔30min振搖一次，如能放置在37℃的恒溫振蕩水浴箱中則更好。消化時(shí)間為1～24h，根據(jù)具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經(jīng)搖動(dòng)即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，可以認(rèn)為已消化充分。經(jīng)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細(xì)胞對(duì)此酶有耐受性，可能有一些細(xì)胞團(tuán)未完全分散，成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng)，因此，如無(wú)特殊需要可以不必進(jìn)一步處理。收集消化液，以1000r／min離心5min，棄上清液。如含個(gè)別較大組織塊及沒(méi)有充分消化的成分，可先用100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾后，取濾液再離心，用Hank′s液或無(wú)血清培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞沉淀1～2次，離心后棄上清液。加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按常規(guī)接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

胰蛋白酶和膠原酶生物活性的比較見(jiàn)表1-16。

表1-16　胰蛋白酶和膠原酶生物活性的比較

c.胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法。

為了提高消化效果，有時(shí)可以采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化的方法。EDTA的作用較胰蛋白酶的作用緩和，適于消化分離傳代細(xì)胞。其主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca^2＋、Mg^2＋，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分離，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。一般EDTA（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）混合的比例為1∶1或2∶1，其中1∶1更為常用。EDTA工作液的濃度為0.02%，用不含Ca^2＋、Mg^2＋的平衡鹽溶液配制。需要特別注意的是，由于EDTA不能被血清等滅活，因而在使用EDTA消化后必須采用離心方法將其去除，否則EDTA在培養(yǎng)液中會(huì)改變Ca^2＋濃度，影響細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)。

d.消化分離法的注意事項(xiàng)。

細(xì)胞消化時(shí)間和細(xì)胞類(lèi)型、消化液的消化能力、細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。一般培養(yǎng)一種新的細(xì)胞要摸索一下消化時(shí)間，掌握消化到什么程度恰到好處。新買(mǎi)的消化液消化能力較強(qiáng)，收到貨后可分裝成小管，按小管一次用完，其余的凍在-20℃下，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可，可放入培養(yǎng)箱中，另外在37℃下酶的活力高于常溫下酶的活力，有利于縮短消化時(shí)間。還有一種方法，就是將胰蛋白酶鋪滿瓶底后，輕搖培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰蛋白酶，利用剩余的少量胰蛋白酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可。細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋70%～80%瓶底時(shí)消化較好，若細(xì)胞密度過(guò)大，則消化后細(xì)胞易成團(tuán)。

注意事項(xiàng)：使用EDTA處理細(xì)胞后，一定要用D-Hank′s液沖洗干凈，因殘留的EDTA會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)；終止消化作用時(shí)，加入一些血清、含血清的培養(yǎng)液或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的消化作用，血清可終止胰蛋白酶的作用，但不能終止EDTA的作用，對(duì)有些細(xì)胞來(lái)說(shuō)，終止消化后的離心、沖洗是必需的；蛋白制劑不宜在4℃長(zhǎng)期保存，切忌反復(fù)凍熔，若大包裝不能較快用完，建議分裝后冷凍保存；細(xì)胞消化之前用D-Hank′s液洗兩遍，使瓶?jī)?nèi)沒(méi)有血清，減少對(duì)胰蛋白酶的中和作用，效果會(huì)好一些。

胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊所需時(shí)間見(jiàn)表1-17。

表1-17　胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊所需時(shí)間（單位：h）

二、原代培養(yǎng)方法

原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段。通過(guò)一定的選擇或純化方法，從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)的細(xì)胞稱(chēng)為細(xì)胞株。假如原代培養(yǎng)能夠維持幾小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間，即可進(jìn)行進(jìn)一步篩選。有的細(xì)胞具有繼續(xù)增殖的能力，有的細(xì)胞只是存活而不增殖，而另外一些細(xì)胞只是在特殊條件下應(yīng)用而不存活，因而細(xì)胞類(lèi)型的分布將會(huì)改變。

原代培養(yǎng)是獲取細(xì)胞的主要手段，但原代培養(yǎng)的細(xì)胞部分生物學(xué)特征尚不穩(wěn)定，細(xì)胞成分多且比較復(fù)雜，即使生長(zhǎng)出同一類(lèi)型細(xì)胞如成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞，細(xì)胞間也存在很大差異。如果供體不同，即使組織類(lèi)型、部位相同，個(gè)體間也存在很大差異。如要做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究，還需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短期傳代后再進(jìn)行。

原代培養(yǎng)方法很多，最基本和常用的有兩種，即組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。

（一）組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡(jiǎn)便易行且成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)的需要作適當(dāng)處理。例如，預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊黏著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng)。如果原代細(xì)胞準(zhǔn)備用于組織染色、電鏡等檢查，可在做原代培養(yǎng)前先在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)放置小蓋玻片，并在放入組織塊前預(yù)先用1～2滴培養(yǎng)液潤(rùn)濕瓶底，使之固定，小蓋玻片要清洗干凈，在消毒前放置。組織塊培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便，部分種類(lèi)的組織細(xì)胞在小塊貼壁培養(yǎng)24h后，細(xì)胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長(zhǎng)成肉眼可以觀察到的生長(zhǎng)暈，5～7d后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去。但由于在反復(fù)剪切和接種過(guò)程中對(duì)組織塊的損傷，并不是每個(gè)小塊都能長(zhǎng)出細(xì)胞。組織塊培養(yǎng)法特別適合于組織量少的原代培養(yǎng)，但組織塊培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，耗時(shí)較長(zhǎng)。

1.操作方法

（1）按照前述培養(yǎng)細(xì)胞取材的基本原則和方法取材、修剪，將組織剪或切成1mm³左右的小塊。在剪切過(guò)程中，可以適當(dāng)向組織上滴加1～2滴培養(yǎng)液，以保持濕潤(rùn)。

（2）將剪切好的組織小塊，用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶中。用牙科探針或彎頭吸管將組織塊均勻擺在瓶壁上，每小塊間距0.2～0.5cm。一般以25mL培養(yǎng)瓶（底面積約為17.5 cm²）放置20～30個(gè)組織小塊為宜，如果瓶?jī)?nèi)有蓋玻片，其上也放置幾塊。將組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，將適量培養(yǎng)液加到非細(xì)胞生長(zhǎng)面上，注意翻瓶時(shí)勿令組織小塊流動(dòng)，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。

（3）放置2～4h，待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，讓液體緩緩覆蓋組織小塊，靜置培養(yǎng)。動(dòng)作要輕巧，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩，以防動(dòng)作過(guò)快使貼附的組織塊受液體沖擊而漂起造成原代培養(yǎng)失敗。若組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶底壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。

組織塊培養(yǎng)也可不用翻轉(zhuǎn)法，即在擺放組織塊后，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)僅加入少量培養(yǎng)液，以能保持組織塊濕潤(rùn)即可。蓋好瓶蓋，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h再補(bǔ)加培養(yǎng)液。

組織塊原代培養(yǎng)如圖1-44所示。

圖1-44　組織塊原代培養(yǎng)

2.注意事項(xiàng)

開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤(rùn)即可，培養(yǎng)24h后再補(bǔ)液。組織塊接種后1～3d，由于游出細(xì)胞數(shù)很少，組織塊的貼附不牢固，在觀察和移動(dòng)過(guò)程中要注意動(dòng)作輕巧，以利于貼壁和生長(zhǎng)，盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其漂起。在原代培養(yǎng)的1～2d內(nèi)，要特別注意觀察是否有細(xì)菌、霉菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細(xì)胞帶來(lái)污染。

對(duì)原代培養(yǎng)要及時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞游出后要照相記錄。原代培養(yǎng)3～5d時(shí)可換液，一方面補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，另一方面去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞，因?yàn)橐哑〉慕M織塊和很多細(xì)胞碎片含有有害物質(zhì)，影響原代細(xì)胞的生長(zhǎng)，要及時(shí)清除。

（二）消化培養(yǎng)法

消化培養(yǎng)法是采用前述的組織消化分離法將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，然后分瓶培養(yǎng)。本方法適用于培養(yǎng)大量組織，原代細(xì)胞產(chǎn)量高，但操作煩瑣、易污染，一些消化酶價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高。

操作方法如下。

（1）按消化分離法收獲細(xì)胞。

（2）在消化過(guò)程中，可隨時(shí)吸取少量消化液在鏡下觀察，如發(fā)現(xiàn)組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，則終止消化。通過(guò)200目的篩網(wǎng)，濾掉組織塊。大組織塊可加入新的消化液繼續(xù)消化。

（3）將已過(guò)濾的消化液800～1000r／min離心5min后，去除上清液，加含血清培養(yǎng)液，輕輕吹打形成細(xì)胞懸液。如果用膠原酶或EDTA消化液等，還要用Hank′s液或培養(yǎng)液洗1～2次后再加培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于培養(yǎng)瓶，置于5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（三）器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或器官組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性是仍保持原有器官的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系，并能存活。器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)與單層細(xì)胞培養(yǎng)的不同，可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長(zhǎng)、變化進(jìn)行體外觀察。器官培養(yǎng)主要強(qiáng)調(diào)器官組織的相對(duì)完整性，重點(diǎn)觀察細(xì)胞在正常聯(lián)系和排列情況下，相互之間的影響和局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用等。

器官培養(yǎng)可提供正常發(fā)育、生長(zhǎng)、分化及外部因子對(duì)這些功能的影響等方面的重要信息。器官培養(yǎng)中的組織比細(xì)胞培養(yǎng)中的組織能更好地成為生理實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通常，體外實(shí)驗(yàn)比活體實(shí)驗(yàn)?zāi)芨斓孬@得結(jié)果，而且如有必要還可定量。實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，器官培養(yǎng)的定量結(jié)果既可重復(fù)又可靠。

1.器官培養(yǎng)的要求

（1）由于體外組織沒(méi)有血液系統(tǒng)供給養(yǎng)分，維持組織細(xì)胞生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來(lái)維持，為使器官組織生長(zhǎng)正常，確保中心不發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺乏性壞死，器官組織的厚度或直徑不宜超過(guò)1mm。

（2）器官組織內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入。常采用以下兩種方法：一是將器官組織塊放置在培養(yǎng)基氣液界面，以利于氣體交換；二是提高培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓，要根據(jù)組織類(lèi)型而定，多數(shù)組織需較高氧分壓，一般要加注純氧，提高氧分壓時(shí)，仍然需保持5%的CO₂，以維持培養(yǎng)液的pH值。

2.操作方法

（1）將不銹鋼網(wǎng)做成支架形狀，放置于培養(yǎng)皿中，高度為4mm或調(diào)整至培養(yǎng)皿的1／2深度平面，在其表面放置0.5μm孔徑的濾膜。

（2）將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。

（3）將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上，厚度應(yīng)為200～1000μm，水平面積不超過(guò)10mm²，如組織為肝、腎等，不能大于1mm³。

（4）將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物放入CO₂培養(yǎng)箱中，并加注氧氣，調(diào)整氧分壓，最好達(dá)到90%。

（5）培養(yǎng)過(guò)程中要注意觀察培養(yǎng)液液面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。不同的器官培養(yǎng)，尚需一些特殊的條件，如某些生長(zhǎng)因子、激素等。

（6）上述器官培養(yǎng)1～3周，每2～3d換液一次，并根據(jù)情況做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。

培養(yǎng)完成后的器官組織小塊，可以取下直接進(jìn)行石蠟包埋、冷凍切片或連同微孔濾膜一起進(jìn)行組織學(xué)研究，也可以分割傳代繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。

三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)要求

（一）貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)要求

（1）凡經(jīng)消化液處理的實(shí)體組織來(lái)源的細(xì)胞要經(jīng)過(guò)充分漂洗，以除去消化液的毒性。

（2）細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×10⁸個(gè)／L。若原代貼壁細(xì)胞不是用于長(zhǎng)期培養(yǎng)，只是用于分離繁殖或測(cè)定病毒，其細(xì)胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利于提高病毒的效價(jià)和使測(cè)定結(jié)果更加明顯、準(zhǔn)確。

（3）培養(yǎng)基可用DMEM。

（4）小牛血清濃度為10%～20%。

（5）創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)環(huán)境，應(yīng)在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（6）在起始的2d中保持靜止，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落、漂浮。

（7）待細(xì)胞貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)的pH值若有明顯變化，應(yīng)將原代細(xì)胞換液，倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基，以便除去衰老、死亡的細(xì)胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細(xì)胞能獲得充足的營(yíng)養(yǎng)。

（二）懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求

（1）凡來(lái)自于胸水、腹水、羊水的組織材料，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞。

（2）若為用于實(shí)驗(yàn)的短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行。

（3）細(xì)胞濃度可在5×10⁹～8×10⁹個(gè)／L范圍內(nèi)，然后進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。

（4）一般待細(xì)胞開(kāi)始增殖甚至結(jié)成小團(tuán)塊時(shí)，培養(yǎng)基中pH值變小，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖良好，每隔3d需半量換液一次。

（5）一般待細(xì)胞增殖加快，濃度明顯增加，pH值發(fā)生明顯變化時(shí)，可考慮傳代。

四、原代細(xì)胞的維持

（一）貼壁細(xì)胞的維持

貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH值變小，不適宜細(xì)胞生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞還未長(zhǎng)成單層，未達(dá)到飽和密度，仍需繼續(xù)培養(yǎng)，因此，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要。棄去舊液，加入與原培養(yǎng)基相同的等量培養(yǎng)液。若希望細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持存活，但不需增殖，則此時(shí)要換成含2%小牛血清的維持液。

（二）懸浮細(xì)胞的維持

凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)而不貼壁的細(xì)胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)現(xiàn)象，細(xì)胞發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH值變小，細(xì)胞不適宜生長(zhǎng)，需進(jìn)行換液。換液時(shí)，只能采用半量換液的方式，千萬(wàn)不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。

知識(shí)拓展

上海長(zhǎng)征醫(yī)院完成神經(jīng)干細(xì)胞的純化分離與原代培養(yǎng)

上海長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科目前已完成神經(jīng)干細(xì)胞的純化分離與原代培養(yǎng)，使我國(guó)在該領(lǐng)域的研究取得了重大突破。

他們借鑒國(guó)內(nèi)外胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞研究的經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)造性地利用先進(jìn)的免疫磁珠細(xì)胞分選系統(tǒng)，對(duì)胚胎大鼠腦組織中的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行多次分離純化、收集，終于獲得純度為93%～99%的神經(jīng)干細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，完全適合進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)及細(xì)胞移植研究。

對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行研究，可以明確其存在部位、生長(zhǎng)條件、分化特性，這是神經(jīng)科學(xué)研究的國(guó)際性熱點(diǎn)課題。這一研究成果一旦用于臨床，可以通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)因腦損傷或腦出血、腦缺血引起的神經(jīng)組織的損傷，恢復(fù)相應(yīng)的神經(jīng)功能。

思考題

1.試述皮膚和黏膜的取材方法。

2.如何進(jìn)行細(xì)胞懸液的分離？

3.貼壁細(xì)胞的維持方法是什么？

4.器官培養(yǎng)的要求有哪些？

5.簡(jiǎn)述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)要求。

6.試述組織塊培養(yǎng)法的操作過(guò)程。

7.簡(jiǎn)述鼠胚組織的取材方法。